Главная \ 3. Пробиотики \ Роль микробиома в развитии и терапии рака \ Дисбактериоз, НЭРБ и аденокарцинома пищевода

Дисбактериоз, НЭРБ и аденокарцинома пищевода

Рефлюксная болезнь желудка, дисбиоз и рак пищевода

Рефлюксная болезнь желудка, дисбиоз и рак пищевода

Выраженный дисбактериоз микробиоты у больных неэрозивной рефлюксной болезнью и аденокарциномой пищевода

Vincent Ho et al.
Distinct Microbiota Dysbiosis in Patients with Non-Erosive Reflux Disease and Esophageal Adenocarcinoma
J. Clin. Med. 2020, 9, 2162

СОДЕРЖАНИЕ

Резюме: Неэрозивная рефлюксная болезнь (НЭРБ) и аденокарцинома пищевода (АП) часто рассматриваются как форзацы в спектре гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ). Тем не менее, существует ограниченное количество клинических данных, подтверждающих эту парадигму заболевания, в то время как основные механизмы прогрессирования заболевания остаются неясными. В этом исследовании мы использовали секвенирование 16S рРНК и масс-спектрометрическую протеомику для характеристики микробиоты пищевода и протеома слизистой оболочки хозяина, соответственно. Всего было проанализировано 70 участников из четырех групп пациентов (НЭРБ, рефлюкс-эзофагит (РЭ), пищевод Барретта (ПБ) и АП) и контрольной группы. Наши результаты показали уникальный состав микробиоты НЭРБ, отличный от контрольной и других групп. Мы предполагаем, что увеличение сульфатредуцирующих протеобактерий и бактероидетов (Proteobacteria and Bacteroidetes) наряду с продуцентом водорода Dorea связано с механистической ролью в висцеральной гиперчувствительности. Мы также наблюдали отчетливую микробиоту АП, состоящую из большого количества бактерий, продуцирующих молочную кислоту (Staphylococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium и Streptococcus), которые могут способствовать канцерогенезу за счет дисрегуляции метаболизма лактата. Это исследование предполагает тесную связь между микробиотой слизистой пищевода и появлением патологий этого органа.

1. Введение

Распространенность гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ) увеличилась за последние два десятилетия и затронула 10–20% населения Запада и 5% в Азии [1]. ГЭРБ традиционно рассматривается как спектральное заболевание, при котором постепенное воздействие на желудочный дистальный отдел пищевода приводит к развитию более серьезных симптомов, повреждения слизистой оболочки и осложнений [2]. Вдоль спектра ГЭРБ неэрозивная рефлюксная болезнь (НЭРБ) находится на мягком конце, прогрессируя в направлении эрозивного рефлюкс-эзофагита (РЭ), пищевода Барретта (ПБ) и, в конечном счете, аденокарциномы пищевода (АП). Тем не менее, существует ограниченная клиническая информация в поддержку этой парадигмы. Например, текущие данные показывают, что только 10% НЭРБ прогрессируют до РЭ [3]. Точно так же частота развития АП у людей с хронической ГЭРБ является относительно низкой (3,2 / 100 000) [4], в то время как до настоящего времени ни медикаментозное, ни хирургическое лечение ГЭРБ и ПБ не показало убедительных доказательств предотвращения развития АП [5]. Таким образом, существует значительный интерес для определения основных механизмов этих рефлюксных заболеваний.

При нормальных обстоятельствах рефлюкс в пищевод предотвращается с помощью антирефлюксного барьерного соединения нижнего пищеводного сфинктера (НПС), внешней краральной (относящейся к мышечным ножкам поясничной части) диафрагмыи опорных структур желудочно-пищеводного клапана. Когда эти защитные компоненты скомпрометированы, вредные эффекты являются аддитивными, что приводит к увеличению рефлюкса. Длительность воздействия рефлюкса определяется эффективностью клиренса пищевода, из которых перистальтика, слюноотделение и наличие грыжи пищевода являются ключевыми определяющими факторами. Сенсорные механизмы в дистальном отделе пищевода определяют связь между воздействием рефлюкса и генерацией симптомов [2]. Кроме того, ряд гормонов модулирует секрецию желудочной кислоты и координирует функцию НПС. Гастрин ингибирует опорожнение желудка и, как показано, одновременно вызывает секрецию желудочной кислоты и сужение НПС. И наоборот, ингибиторы желудочной кислоты, секретин и нейротензин, также снижают тонус НПС [6]. В последние годы микробиота пищевода человека стала ассоциироваться с развитием рефлюксной болезни. Исследования с использованием секвенирования генов 16S рРНК выявили специфические профили микробиоты, связанные с ГЭРБ. Yang et al. [7], в 2009 году было выявлено изменение в популяции грамотрицательных бактерий в РЭ- и ПБ-микробиоме, в то время как Blackett et al. [8] объединили оценку, основанную на культивировании и секвенировании, и обнаружили высоко распространенную грамположительную бактериальную популяцию в биопсиях АП. Недавно в японском исследовании был проведен уникальный тест для количественной оценки общих бактериальных нагрузок с помощью количественной ПЦР гена 16S рРНК [9]. Исследование показало, что относительная распространенность таксонов (Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Fusobacteria и Actinobacteria), а не абсолютные бактериальные нагрузки, скорее всего, более актуальны для заболеваний пищевода.

Чтобы исследовать причинность и микробный дисбиоз в патогенезе рефлюксной болезни, мы стремимся охарактеризовать микробиоту пищевода и основной протеом слизистой оболочки хозяина. Предыдущие исследования характеризовали состав микробиоты в слизистой оболочке пищевода в конкретных условиях в спектре ГЭРБ (РЭ и ПБ [7] и АП [8]), однако микробиота через последствия нарушений кислотного рефлюкса остается неисследованной. Учитывая прогрессивную природу ГЭРБ, мы предположили, что изучение микробиоты слизистой пищевода и основного протеома хозяина по всему спектру ГЭРБ позволит получить представление о прогрессировании заболевания и возможных механизмах патогенеза.

2. Материал и методы

2.1. Проектирование исследования и отбор проб

Сбор проб был одобрен Комитетом по этике исследований местного округа здравоохранения Юго-Западного Сиднея (HREC / 16 / LPOOL / 143; 09 июня 2016 г.), Университет Западного Сиднея (RH11759; 07 июля 2016 г.), учреждение здравоохранения местного округа Nepean Blue Mountains (SSA / 18 / NEPEAN / 35 01 марта 2017 г.). От участников было получено письменное согласие.

Образцы для анализа были получены от пациентов, проходивших рутинную диагностическую эндоскопию верхних отделов желудочно-кишечного тракта для изучения симптомов в больнице Кэмпбеллтаун (Сидней, Новый Южный Уэльс, Австралия) в период с 2017 по 2018 год. Всего было набрано 70 человек и классифицировано на 1 из 5 фенотипов на основе симптоматических и гистопатологических характеристик (табл.1): (1) контрольные группы (n = 16) были отобраны из числа лиц, направленных на эндоскопию для исследования железодефицитной анемии или болей в нижней части живота, у которых не было эндоскопических признаков заболеваний пищевода, желудка или двенадцатиперстной кишки. Биопсия слизистой оболочки была получена и подтверждена гистологически нормальной в контрольных образцах. Был использован простой опросник симптомов ГЭРБ: пациентов спрашивали о наличии и частоте шести специфических симптомов (изжога, регургитация, боль в эпигастрии или груди, полнота эпигастрия, дисфагия и кашель), испытываемых в течение последних 3 месяцев. Пациенты контрольной группы не испытывали никаких симптомов. (2) участники НЭРБ (n = 11) не имели эндоскопических признаков заболевания пищевода и нормальной гистологии, но испытывали симптомы рефлюкса в течение последних 3 месяцев. (3) участники РЭ (n = 20) имели эндоскопические признаки эзофагита, основанные на Лос-Анджелесской классификации. (4) участники ПБ (n = 17) имели не менее 1 см столбчатого выстланного пищевода и наличие кишечной метаплазии, подтвержденной гистологически. (5) участники АП (n = 6) были набраны из больницы Кэмпбелтаун и больницы Непин (Сидней, Новый Южный Уэльс, Австралия) в период с 2017 по 2018 год. Диагноз АП был подтвержден гистологией. Образцы были взяты во время исследования. Пациенты были в возрасте > 18 лет, и критерием исключения было использование лекарств, которые могли нарушить микробиоту, а именно антибиотиков или пробиотиков в течение 3 месяцев исследования.

Таблица 1. Характеристики субъектов

Группа
Контроль
НЭРБ
РЭ
ПБ
АП
Переменные
Субъекты
16
11
 20
 17
6
Пол (Мужской : Женский)
2:14
3:9
6:14
12:5
6:0
Средний возраст (квартили 1 – 3)
52 (36–64)
63 (66–51)
 55 (43–65)
 58 (49–69)
67 (62–70)
Симптомы рефлюкса
0
11 (100%)
18 (90%)
10 (59%)
3 (50%)
Рефлюкс-лекарство
Ингибитор протонной помпы
0
4 (36%)
10 (50%)
10 (59%)
1 (17%)
Воспаление / наличие лимфоцитов
0
0
17 (85%)
4 (24%)
1 (17%)
Аномальная клеточная морфология
Гиперплазия
0
0
7 (35%)
0
 0
Метаплазия
0
0
0
16 (94%)
 0
Дисплазия
0
0
0
1 (6%)
 
Аденокарцинома
0
0
0
0
6 (100%)

НЭРБ: неэрозивная рефлюксная болезнь; РЭ: рефлюкс-эзофагит; ПБ: пищевод Барретта; АП: аденокарцинома пищевода.

Образцы цитологической щетки (Cook Medical, Bloomington, IN, USA) и эндоскопические биопсии слизистой оболочки брали во время введения, чтобы минимизировать загрязнение. Цитологические щетки были закрыты и эндоскопически вставлены в целевой участок, где были проведены 3 повторных чистки по всему участку, перед тем как кисти (щетки) были повторно укупорены и удалены. У каждого пациента были взяты две биопсии, на 1 см выше демаркационной линии (плоскоклеточный столб) или в месте патологии. Одна биопсия была использована для гистологии, другая биопсия и образец кисти были помещены в отдельные стерильные пробирки, быстро заморожены в жидком азоте при -80 °C и транспортированы замороженными для лабораторного анализа.

2.2. Анализ микробиома пищевода

Экстракцию бактериальной ДНК проводили с помощью набора Purelink Microbiome DNA Purification kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Чистоту бактериальной дсДНК определяли с помощью Нанофотометра, а концентрацию - с помощью набора для анализа дсДНК широкого спектра Qubit dsDNA и кубитового Флуорометра 2.0 (Invitrogen). Квалифицированные образцы ДНК были отправлены в австралийский исследовательский центр генома (AGRF, Сидней, Новый Южный Уэльс, Австралия) для профилирования разнообразия. Секвенирование ампликонов осуществляли с целью определения гипервариабельной области (V1-V3, 27F / 529R) гена 16S рРНК на платформе Illumina MiSeq (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США) с использованием индекса Illumina Nextera XT с парно-концевым секвенированием. Необработанные парные считывания Illumina были обрезаны с помощью Cutadapt [10]. Анализ последовательностей проводился с использованием количественного анализа микробной экологии 2 (версия QIIME 8.0.1623) [11]. В общей сложности было получено 8457356 необработанных последовательностей считывания, а качественная фильтрация привела к 3221362 считываниям. Затем последовательности были сгруппированы в операционные таксономические единицы (OTUs) в соответствии с конвейером QIIME2 по умолчанию со ссылкой на 99%-ное сходство последовательностей с базой данных Greengenes версии 13.8 [12]. Показатели Альфа-разнообразия включали наблюдаемые OTUs, Chao1 и индекс Шеннона. Бета-разнообразие было проанализировано на основе расстояний Брэя Кертиса и Джаккарда. Перестановочный многомерный дисперсионный анализ (PERMANOVA [13]) и перестановочный многомерный дисперсионный анализ (PERMDISP) были выполнены в PRIMER version 6 (PRIMER-E, Великобритания) [14]. Визуализацию проводили с помощью неметрического многомерного шкалирования (nMDS). Сравнение относительной численности на уровнях таксономии различных групп проводилось с использованием многомерных обобщенных линейных моделей (GLM), предполагающих отрицательное биномиальное распределение в пакете R «mvabund» [15], а значимые пары определялись с помощью попарного критерия Манна-Уитни.

2.3. Анализ протеома пищевода

Биоптаты (прижизненный забор клеток, тканей – ред.) растворяли в буферном растворе, содержащем коктейль ингибиторов протеаз 2% (v/v) (Roche Australia, Sydney, NSW, Australia), RapiGest SF (0,1% w/v) (Waters, MA, USA) и 75 mM водного бикарбоната аммония. Суспензию клеток разрушали повторными циклами замораживания-оттаивания в жидком азоте и на водяной бане при температуре 50 °C. Смесь лизата (продукт лизиса бактериальных клеток – ред.) нагревали при 95 °С в течение 1 ч с последующим повторением циклов замораживания–оттаивания. Концентрацию белка в лизате определяли количественно с помощью набора для анализа бицинхониновой кислоты (ThermoFisher Scientific, Сидней, Новый Южный Уэльс, Австралия) в соответствии с инструкциями производителя.

Восстановление осуществляли с помощью 5 mM дитиотреитола (Calbiochem, Kenilworth, NJ, USA) и алкилированием с помощью 15 mM йодацетамида (Merck, Kenilworth, NJ, USA). Образцы белка расщепляли при массовом соотношении белок:фермент 100: 1 (w/w) с помощью масс-спектрометра марки trypsin (Promega Gold, Madison, WI, USA) при 37 °С в течение ночи. Реакцию останавливали с помощью 0,4% (v/v) водной трифторуксусной кислоты (TFA), и липиды удаляли из пептидов посредством твердофазной экстракции на гидрофильно-липофильном балансе Oasis (HLB) 30 мг, картриджи 1 мл (Waters Corp., Milford, М.А., США). Образцы промывали 0,1% (v/v) TFA и ультрачистой водой. Пептиды элюировали 70% (v/v) водным ацетонитрилом. Растворители выпаривали с использованием роторного вакуумного концентратора до добавления 0,1%-ной водной муравьиной кислоты. После обработки ультразвуком и центрифугирования в течение 10 минут супернатанты переносили в хроматографические флаконы Total Recovery (Waters) для анализа. Анализ ЖХ / МС проводился с использованием масс-спектрометра Waters nanoAcquity UPLC и Waters Xevo QToF. Анализ ЖХ-МС / МС триптических расщеплений осуществляли путем инъекции 3 мкл раствора образца, загруженного со скоростью 5 мкл / мин, в улавливающую колонку (ловушку). Образец обессоливали при следующем составе растворителя: 1% ацетонитрил + 0,1% муравьиная кислота (растворитель В) в воде + 0,1% муравьиная кислота (растворитель А). Пептиды были смыты с ловушки при 400 нл / мин на аналитическую колонку с использованием следующего 60-минутного линейного метода: через одну минуту исходный состав растворителя, равный 1% В, линейно увеличивали до 50% В к 31 мин. Непосредственное линейное изменение в течение двух минут до 85% B было начато немедленно. Эту композицию выдерживали от 33 до 36 мин, после чего композицию растворителя возвращали к исходным условиям. После разделения пептиды анализировали с помощью тандемной масс-спектрометрии в непрерывном режиме, используя следующие условия прибора: капиллярное напряжение 2,3 кВ, конусное напряжение 25 В, экстракционный конус 4 В, температура источника 80 °C, поток конического газа (N2) 20 л/ч, нано-поток газа 0,50 л/ч, продувочный газ 100 л/ч, напряжение детектора 2350 В. Точность массы поддерживалась коррекцией фиксации массы, достигаемой инфузией в 0,5 мкл / мин раствора лейцин-энцефалина 200 нг/мл в 50% водном ацетонитриле плюс 0,1%-ной муравьиной кислоте. Был проведен эксперимент по сбору данных (DDA), который непрерывно сканировал пептиды с заряженным состоянием от 2+ до 4+ с интенсивностью более 50 импульсов в секунду в диапазоне m/z 350–1500. Три наиболее распространенных иона, удовлетворяющих этим условиям, были фрагментированы по три секунды каждый, и полученные спектры МС/МС были собраны в диапазоне m/z 50–2000. Затем массу каждого пептида-предшественника исключали в течение 30 с. Энергии столкновения для родительских ионов пептида были увеличены с 15 до 25 В при m/z от 350 до 30–40 В при m/z 1500. Затем массу предшественника пептида исключали в течение 30 с.

Данные трех технических реплицирующих экспериментов для каждой выборки были проанализированы качественно и количественно с помощью программного обеспечения Progenesis QI (Нелинейная динамика, Милфорд, Массачусетс, США). Пиковый выбор осуществляется там, где исходные данные MS-спектров сводятся к набору обнаруженных пептидов и пептидных ионов. Идентификация белков была получена путем экспорта в MASCOT 2.6.00 (Matrix Science) с помощью встроенного алгоритма учета ионов программного обеспечения и поиска в базе данных человека (UniProt KB/Swiss-Prot Protein Knowledge Base release 2018_10 от 20 октября 2018 года). Вариабельные модификации карбамидометила (С), дезамидированного (NQ), окисленного (М) и проионамида (С) были использованы с допусками по массе пептида и MS / MS 0,05 Da. Для относительного количественного определения белка интенсивность репортерных ионов тандемной массы (TMT) экстрагировали для каждого пептида. Коррекция изотопной чистоты проводилась в рамках Progenesis QI для каждого репортера на основе изотопного распределения репортеров sixplex-TMT, предоставленных производителем. Статистические тесты проводились с использованием SPSS версии 25 (IBM, Армонк, Нью-Йорк, США), которая включала тест Шапиро-Уилка, H-критерий Крускала-Уоллиса, U-критерий Манна-Уитни и критерий однородности дисперсии Левена. Инструмент STRING версии 11.0 [16] (http://www.stringdb.org) использовался для построения сетей взаимодействия белков и выявления общих биологических процессов.

3. Результаты

3.1. Характеристика микробиоты слизистой оболочки ГЭРБ и АП

Всего было выявлено 13 типов, 87 родов и 48 таксономических единиц видового уровня. Анализ альфа-разнообразия показал, что оценка богатства Chao1 (дополнительный рисунок S1) была значительно снижена у НЭРБ по сравнению с контролем (Pchao1 = 0,041) и РЭ (Pchao1 = 0,022), в то время как индекс разнообразия Шеннона не показал различий между группами. Анализ бета-разнообразия проводили с использованием расстояний Брэя-Кертиса и Джаккарда (дополнительный рисунок S2). Парный тест (PERMANOVA) и тест дисперсии (PERMDISP) выявили достоверные различия между контролем и разнообразием АП (PANOVA < 0.006, PDISP = 0.030). Состав микробиоты внутри каждой группы представлен на дополнительном рисунке S3.

3.2. Ключевые OTUs коррелирующие с прогрессированием ГЭРБ и АП

Для выявления микробов-кандидатов патогенеза ГЭРБ и АП мы исследовали различия в составе микробиоты пищевода на разных стадиях ГЭРБ (от НЭРБ до РЭ) и в АП. Многомерный анализ выявил 41 дифференциальный OTUs в пределах 9 типов (Рис.1). Конкретные дифференциальные OTUs представлены на Рис.2, а значимые пары выборок суммированы в таблице 2.

Дифференцированные оперативные таксономические единицы (OTUs) на уровне типа между неэрозивной рефлюксной болезнью (NERD), рефлюкс-эзофагитом (RE), пищеводом Барретта (BE), аденокарциномой пищевода (EAC) и контрольными группами.

Рисунок 1. Дифференцированные оперативные таксономические единицы (OTUs) на уровне типа между неэрозивной рефлюксной болезнью (NERD), рефлюкс-эзофагитом (RE), пищеводом Барретта (BE), аденокарциномой пищевода (EAC) и контрольными группами.

Тепловая карта представляет 41 дифференцированную оперативную таксономическую единицу (OTUs) между контролем (CON; n = 16) и фенотипами заболеваний (неэрозивная рефлюксная болезнь (NERD; n = 11), рефлюкс-эзофагит (RE; n = 20), пищевод Барретта (BE; n = 17) и аденокарцинома пищевода (EAC; n = 6)).

Рисунок 2. Тепловая карта представляет 41 дифференцированную оперативную таксономическую единицу (OTUs) между контролем (CON; n = 16) и фенотипами заболеваний (неэрозивная рефлюксная болезнь (NERD; n = 11), рефлюкс-эзофагит (RE; n = 20), пищевод Барретта (BE; n = 17) и аденокарцинома пищевода (EAC; n = 6)). OTUs от каждого фенотипа заболевания сравнивались с помощью многовариантного анализа (anova.manyglm; p-значение < 0,05). p-значения приведены в скобках (), таксоны, классифицированные выше уровня рода, обозначены в [ ]. Попарный анализ выявил различия в OTUs, связанные с определенным фенотипом заболевания(ий), эти маркеры сгруппированы черными контурами. Тренд изменения для каждого маркера в пределах фенотипа обозначен стрелкой.

Таблица 2. Значимые пары в пределах 41 дифференцированной оперативной таксономической единицей (OTUs) между неэрозивным рефлюксом (NERD; n = 11), рефлюкс-эзофагитом (RE; n = 20), пищеводом Барретта (BE; n = 17), аденокарциномой пищевода (EAC; n = 6) и контролем.

OTUs
p-значение
Отдельная группа/ы
Значимые Пары
(p-значение < 0.05)
Firmicutes | Tissierellaceae [семейство]
0.001
Больше всего в контроле
NERD–Контроль (0.027); RE–Контроль (0.002); BE–Контроль (0.011)
Firmicutes | Pseudoramibacter eubacterium
0.006
Больше всего в контроле
RE–Контроль (0.001); RE–BE (0.031)
Firmicutes | Clostridiaceae [семейство]
0.013
Больше всего в контроле
RE–Контроль (0.005); BE–Контроль (0.012)
Actinobacteria | Rubrobacter
0.006
Больше всего в контроле
NERD–Контроль (0.037); RE–Контроль (0.009); BE–Контроль (0.047)
Actinobacteria | Geodermatophilus
0.014
Больше всего в контроле
RE–Контроль (0.022); BE–Контроль (0.044)
Bacteroidetes | Bacteroides uniformis
0.016
Больше всего в NERD
Контроль–NERD (0.026); BE–NERD (0.016)
Bacteroidetes | Capnocytophaga
0.017
Больше всего в NERD
RE–NERD (0.009); BE–NERD (0.023); BE–EAC (0.046)
Proteobacteria | Neisseria oralis
0.007
Больше всего в NERD
RE–NERD (0.004); EAC–NERD (0.008)
Proteobacteria | Moraxella
0.049
Больше всего в NERD
BE–NERD (0.025)
Firmicutes | Dorea
0.001
Больше всего в NERD
Контроль–NERD (0.001); RE–NERD (0.001); BE–NERD (0.001); EAC–NERD (0.001); RE–Контроль (0.016)
Bacteroidetes | Prevotella pallens
0.019
Больше всего в NERD
RE–NERD (0.017); BE–NERD (0.014)
Firmicutes | Acidaminobacteraceae [семейство]
0.024
Больше всего в NERD
BE–NERD (0.047); RE–NERD (0.047)
Fusobacteria | Leptotrichia
0.001
Меньше всего в NERD
NERD–Контроль (0.001); NERD–RE (0.001); NERD–BE (0.001); NERD–EAC (0.005)
Actinobacteria | Rothia
0.001
Меньше всего в NERD
NERD–Контроль (0.002); NERD–RE (0.001); NERD–BE (0.007); NERD–EAC (0.029)
Firmicutes | Peptococcus
0.001
Меньше всего в NERD
NERD–Контроль (0.012); NERD–RE (0.001); NERD–BE (0.002); NERD–EAC (0.027)
Firmicutes | Moryella
0.001
Меньше всего в NERD
NERD–Контроль (0.001); NERD–RE (0.001); NERD–BE (0.001); NERD–EAC (0.001)
Firmicutes | Peptostreptococcaceae [семейство]
0.001
Меньше всего в NERD
NERD–Контроль (0.009); NERD–RE (0.004); NERD–EAC (0.036); BE–RE (0.002); EAC–RE (0.022); Контроль–BE (0.003)
Firmicutes | Aerococcaceae [семейство]
0.012
Меньше всего в NERD
NERD–Контроль (0.002); NERD–RE (0.022); EAC–Контроль (0.011)
Tenericutes | Mollicutes RF39 [порядок]
0.020
Меньше всего в NERD
NERD–Контроль (0.012); NERD–RE (0.028); NERD–BE (0.008)
Firmicutes | Bacilli [класс]
0.008
Больше всего в RE
NERD–RE (0.013); BE–RE (0.002)
Bacteroidetes | Bacteroidales S24-7
0.012
Больше всего в RE
NERD–RE (0.012); BE–RE (0.010); BE– Контроль (0.030)
Verrucomicrobia | Akkermansia muciniphila
0.005
Больше всего в RE
Контроль–RE (0.011); NERD–RE (0.022); BE–RE (0.011)
Proteobacteria | Marivita
0.009
Больше всего в RE
Контроль–RE (0.022); NERD–RE (0.026); Контроль–BE (0.028)
Bacteroidetes | Bacteroidales [порядок]
0.001
Меньше всего в RE
NERD–Контроль (0.003); RE–Контроль (0.001); RE–BE (0.002); RE–EAC (0.001)
Firmicutes | Solobacterium moorei
0.012
Меньше всего в RE
RE–Контроль (0.010); RE–NERD (0.004); RE–EAC (0.013)
Firmicutes | Streptococcus infantis
0.001
Меньше всего в RE/BE
RE–Контроль (0.012); RE–NERD (0.004); RE–EAC (0.002); BE–Контроль (0.015); BE– NERD (0.001); BE–EAC (0.001)
Firmicutes | Shuttleworthia
0.001
Больше всего в BE
Контроль–BE (0.004); NERD–BE (0.017); RE–BE (0.002); EAC–BE (0.003); NERD– EAC (0.007); Контроль–EAC (0.004)
Acidobacteria | Acidobacteria-6
0.005
Больше всего в BE
RE–BE (0.006); NERD–BE (0.035); RE– Контроль (0.015)
Proteobacteria | Nisaea
0.010
Больше всего в BE
Контроль–BE (0.009); NERD–BE (0.024); Контроль–RE (0.043)
Proteobacteria | Mesorhizobium
0.028
Больше всего в BE
Контроль–BE (0.022); NERD–BE (0.041)
Firmicutes | Mogibacterium
0.023
Меньше всего в BE
BE–Контроль (0.030); BE–NERD (0.014); BE–RE (0.012)
Proteobacteria | Haemophilus influenzae
0.003
Больше всего в EAC
Контроль–BE (0.013); RE–BE (0.004); BE– EAC (0.013); Контроль–EAC (0.015)
Unknown/Unassigned
0.003
Больше всего в EAC
Контроль–EAC (0.003); NERD–EAC (0.015); BE–EAC (0.002); RE–EAC (0.002)
Firmicutes | Staphylococcus aureus
0.025
Больше всего в EAC
Контроль–EAC (0.014); BE–EAC (0.010)
Actinobacteria | Bifidobacterium
 0.003
Больше всего в EAC
Контроль–EAC (0.002); NERD–EAC (0.004); BE–EAC (0.001)
Spirochaetes | Sphaerochaeta
0.004
Больше всего в EAC
Контроль–EAC (0.025); NERD–EAC (0.033); BE–EAC (0.015); RE–EAC (0.020)
Proteobacteria | Sinobacteraceae
0.009
Больше всего в EAC
NERD–EAC (0.028); BE–EAC (0.014); RE–EAC (0.018)
Firmicutes | Lactobacillus salivarius
0.017
Больше всего в EAC
RE–EAC (0.038); BE–EAC (0.041)
Proteobacteria | Rhodospirillaceae [семейство]
0.018
Больше всего в EAC
Контроль–EAC (0.018); NERD–EAC (0.037); RE–EAC (0.021)
Actinobacteria | Rothia mucilaginosa
0.013
Минимально в EAC
EAC–Контроль; EAC–NERD (0.023); EAC–BE (0.032); EAC–RE (0.001)
Bacteroidetes | Prevotella copri
0.039
Минимально в EAC
EAC–RE (0.003); EAC–BE (0.001); NERD–RE (0.030)

Контрольная микробиота имела более высокий уровень грамположительных Firmicutes (фирмикутов) и Actinobacteria (актинобактерий) по сравнению с другими группами. Состав микробиоты НЭРБ сместился в сторону протеобактерий (Neisseria oralis и Moraxella sp.) и бактероидетов (Bacteroidesiformis, Capnocytophaga sp. и Prevotella pallens), и от фузобактерий (Leptotrichia) и актинобактерий (Rothia). Несколько родов Firmicutes были снижены при НЭРБ (Peptococcus и Moryella), в то время как повышенное содержание Dorea привело к общему более высокому составу Firmicutes по сравнению с контролем. Микробиота РЭ и ПБ характеризовалась сдвигом от Firmicutes (Mogibacterium sp., Streptococcus infantis, Solobacterium moorei) к грамотрицательным Fusobacteria (Leptotrichia sp.) и Proteobacteria (Marivita, Nisaea, Mesorhizobium) относительно контроля. Микробиота АП характеризовалась сдвигом в сторону Firmicutes, главным образом Staphylococcus aureus, Streptococcus infantis, Moryella sp. и Lactobacillus salivarius, и Proteobacteria, и в то же время вдали от Actiobacteria (Rothia mucilaginosa) относительно контроля.

3.3. Функциональные изменения в протеоме слизистой оболочки хозяина ГЭРБ и АП

Чтобы получить механистическое понимание роли микробов и микросреды в ГЭРБ и АП, мы провели объективный количественный протеомный анализ эндоскопической биопсии слизистой оболочки, собранной в той же области пищевода, где были получены щеточные образцы микробиомов. Всего было подсчитано 378 белков; из них только 26 белков имели медианное соотношение выше 10-кратного и > 2 уникальных пептидов. Пятнадцать (15) количественно определенных белков были идентифицированы как дифференциально экспрессированные между тестируемыми группами (тест Крускала-Уоллиса р <0,05) (рис. 3). Значимые пары групп были идентифицированы и суммированы в таблице 3. Анализ белковых цепочек (Рис.4) выявил основную группу белков, повышенных в образцах РЭ и ПБ, ассоциированных с реакцией на токсические вещества: Аннексин-А1, реакцией на внеклеточный стимул: кератин 20, шаперон эндоплазматического ретикулума BiP (HSPA5) и связанный с окислительной детоксификацией: сывороточный альбумин, желудочная триацилглицеролипаза (фермент GSTP1) и бета-субъединица гемоглобина. Несколько эпителиальных маркеров были повышены в отношении РЭ, кератина 13, кератина 20 и гастрокина-1 по сравнению с другими группами, в то время как маркеры неоплазии десмин и виментин были повышены в ПБ и АП по сравнению с контролем.

Представлено обилие белка в 15 дифференциальных белках между фенотипами контроля и заболевания

Рисунок 3. Представлено обилие белка в 15 дифференциальных белках между фенотипами контроля и заболевания. p-значения, полученные с помощью теста Крускала-Уоллиса, отображаются в скобках ( ). Неэрозивная рефлюксная болезнь (NERD); рефлюкс-эзофагит (RE); пищевод Барретта (BE); аденокарцинома пищевода (EAC); субъединица АТФ-синтазы бета (ATP5B); глутатион S-трансфераза p (GSTP1); шаперон эндоплазматического ретикулума BiP (HSPA5).

Карта межбелкового взаимодействия 15 дифференциальных белков между тестируемыми группами.

Рисунок 4. Карта межбелкового взаимодействия 15 дифференциальных белков между тестируемыми группами. Три биологических процесса были характерны для прогрессирования заболевания. Узлы являются репрезентативными для видов белков, а линии представляют белково-белковые ассоциации. Узлы одного цвета и / или соединенные линиями представляют общую функцию. Инструмент STRING (http://www.string-db.org) использовался для построения сетей взаимодействия. Десмин (DES); виментин (VIM); аннексин А1 (ANXA1); преламин-A/C (LMNA); сывороточный альбумин (ALB); глутатион-S-трансфераза р (GSTP1); бета-субъединица гемоглобина (HBA2); шаперон эндоплазматического ретикулума BiP (HSPA5); протеин дисульфид-изомераза (P4HB); Бета-субъединица АТФ-синтазы (ATP5B); 14-3-3 белок тета (YWHAQ); желудочная триацилглицеролипаза (LIPF); гастрокин-1 (GKN1); кератин 13 (KRT13); кератин 20 (KRT20).

Таблица 3. Значимые пары в пределах 15 дифференциальных белков между неэрозивным рефлюксом (NERD), рефлюкс-эзофагитом (RE), пищеводом Барретта (BE), аденокарциномой пищевода (EAC) и контролем.

Белок
p-значение
Отдельная группа/ы
Значимые Пары
(p-значение < 0.05)
Кератин 13
0.017
Больше всего в RE
BE–RE (0.002); EAC–RE (0.021); NERD–RE (0.039)
Сывороточный альбумин
0.003
Низко в Контроль/NERD
NERD–RE (0.001); NERD–BE (<0.001); Контроль–BE (0.030)
Виметин
0.009
Меньше всего в NERD
NERD–BE (<0.001); NERD–RE (0.007); Контроль–BE (0.013)
Альфа-субъединица гемоглобина
0.016
Низко в NERD/EAC
NERD–RE (0.010); NERD–BE (0.010); EAC–BE (0.042)
Бета-субъединица АТФ-синтазы
0.016
Меньше всего в NERD
NERD–RE (0.003); NERD–BE (0.004)
Белковая дисульфид-изомераза
0.004
Высоко в RE/BE
NERD–RE (0.006); NERD–BE (0.008); EAC–RE (0.011); EAC–BE (0.013); Контроль–BE (0.033); Контроль–RE (0.039)
Гастрокин-1
0.034
Низко в Контроль/NERD
Контроль–BE (0.007); NERD–RE (0.015)
Глутатион-S-трансфераза p (GSTP1)
0.038
Высоко в RE/BE
NERD–RE (0.014); CON–RE (0.031); NERD–BE (0.034)
Десмин
0.020
Меньше всего в NERD
NERD–BE (0.004); NERD–RE (0.005); NERD–EAC (0.007); Контроль–EAC (0.011)
Шаперон эндоплазматического ретикулума BiP (HSPA5)
0.035
Меньше всего в NERD
NERD–BE (0.007); NERD–RE (0.008)
Желудочная триацилглицеролипаза
0.010
Высоко в RE/BE
Контроль–BE (0.004); CON–RE (0.012); NERD–BE (0.026)
Кератин 20
0.009
Больше всего в RE
BE–RE (0.008); NERD–RE (0.010); EAC–RE (0.017); BE–Контроль (0.047)
14-3-3 белок тета
0.009
Больше всего в RE
NERD–RE (0.002); EAC–RE (0.009); BE–RE (0.014)
Преламин-A/C
0.014
Низко в Контроль/NERD
NERD–RE (0.004); NERD–BE (0.010); Контроль–RE (0.017)
Аннексин А1
0.008
Низко в RE
NERD–RE (0.009); Контроль–RE (0.010); EAC–RE (0.012)

4. Обсуждение

В этом исследовании мы обнаружили отчетливую микробиоту пищевода у пациентов с НЭРБ, РЭ, ПБ и АП, что дает представление о молекулярных механизмах рефлюкс-ассоциированных заболеваний и потенциально новых направлениях стратификации заболеваний. Наше исследование показало, что общий состав микробиоты был изменен у НЭРБ и АП по сравнению с контролем, в то время как уникальные OTUs, присутствующие при НЭРБ и АП, не были обнаружены у пациентов с РЭ и ПБ.

Накопленные данные подтверждают характеристику НЭРБ как отдельного объекта от других заболеваний в спектре ГЭРБ. Гетерогенность у пациентов с НЭРБ была предположена, когда эта группа менее благоприятно реагировала на терапию подавления кислоты по сравнению с пациентами с РЭ [17]. Позднее это было продемонстрировано в ходе длительных исследований рН, которые показали, что у 30–50% пациентов с НЭРБ было нормальное время воздействия кислоты, но наблюдалась рефлюксная гиперчувствительность [18,19]. Недавнее протеомное исследование показало, что НЭРБ и эрозивно-рефлюксная болезнь являются различными заболеваниями, при этом у пациентов с НЭРБ сохраняется способность восстанавливать слизистую оболочку пищевода после кислотно-пепсиновых инсультов, в то время как у пациентов с эрозивно-рефлюксным заболеванием способность снижается [20]. Здесь мы продемонстрировали, что микробиота НЭРБ отклоняется от парадигмы микробиоты ГЭРБ [7], заключающейся в увеличении количества грамотрицательных бактерий (Fusobacteria и Proteobacteria) и снижении грамположительных Firmicutues (Streptococcus), наблюдаемых в нашей РЭ и ПБ микробиоте. Наш анализ протеома также показывает отсутствие значительных изменений в белках НЭРБ по сравнению с контролем, в то время как в РЭ наблюдались повышенные уровни белков реакции на стресс. Большинство наших пациентов с НЭРБ (64%) принимали ингибиторы протонной помпы из-за отсутствия реакции; поэтому мы постулируем, что уникальная микробиота НЭРБ может быть связана с гиперчувствительностью рефлюкса. Роль микробиоты в двунаправленном перекрестном разговоре между кишечником и мозгом еще далеко не установлена. Недавнее исследование синдрома раздраженного кишечника (СРК) показало, что передача фекальной микробиоты от гиперчувствительных пациентов с СРК крысам без микробов сопровождается передачей висцеральной гиперчувствительности при отсутствии каких-либо аномалий слизистой оболочки и изменения проницаемости кишечника [21]. Авторы сообщают о дисбиозе, характеризующемся значительным увеличением протеобактерий (в том числе сульфатредуцирующих Enterobacteriacaea и Desulfohalobioaceae) у мышей с СРК, и предполагают, что проноцицептивная роль люминального сероводорода (H2S) вызывает возбуждение сенсорных нервов посредством активации каналов Т-типа. Последние данные свидетельствуют о том, что H2S действует на преходящий рецепторный потенциал анкирина 1 (TRPA1) непосредственно в афферентных нейронах толстой кишки, усиливая ноцицептивную функцию [22]. Наши данные НЭРБ также показывают значительное увеличение протеобактерий и бактероидетов (включая Neisseria, Prevotella и Bacteroides с сульфатредуцирующими способностями у некоторых видов), наряду с более высокой распространенностью производителя газообразного водорода Dorea sp. Хотя специфические сульфатредуцирующие бактерии, идентифицированные у пациентов с СРК, не были идентифицированы в дистальном отделе пищевода наших пациентов с НЭРБ, их особая микробиота требует дальнейшего изучения механистической роли взаимодействия микробиота-хозяин.

Длительный желудочный рефлюкс с последующей инфильтрацией воспалительных клеток в слизистую пищевода являются преобладающими микросредовыми характеристиками РЭ и ПБ. В этих условиях наша РЭ и ПБ микробиота показала характерный сдвиг от грамположительных видов Firmicute к грамотрицательным Fusobacteria и Proteobacteria по сравнению с контролем. Это согласуется с прошлыми исследованиями у пациентов с РЭ и ПБ [7,23,24]. Здоровый дистальный отдел пищевода питает преимущественно Firmicutes перорального происхождения (70–87%). Это изменено в RE и BE, чтобы напоминать желудочную микробиоту, которая состоит из меньшего количества Firmicutes (22–30%) и большего количества грамотрицательных бактерий [25]. Хотя в этом исследовании не оценивалась микробиота полости рта или желудка, вполне вероятно, что пищевод постоянно подвергается воздействию преходящих колонизаторов из слюны полости рта и желудочного рефлюкса. Изменения в микробиоте пищевода отражают источник преходящих бактерий и микросреды. В случае РЭ и ПБ повышенное воздействие желудочного рефлюкса в сочетании с кислой микроокружающей средой привело к изменению состава желудочных бактерий. Растет интерес к желудочным бактериям Helicobacter pylori и их роли в рефлюксных заболеваниях. Ликвидация H. pylori совпала с увеличением распространенности ГЭРБ и повышенным риском ПБ. Хотя состав H. pylori существенно не различался между нашими группами, известно, что эти бактерии модулируют некоторые гормоны (гастрин, грелин и лептин) и могут оказывать косвенное влияние на ГЭРБ [26], а также на метаболизм хозяина [27] и другие органы, такие как поджелудочная железа [28].

Протеом РЭ и ПБ продемонстрировал согласованные усилия по обеспечению выживания клеток за счет повышенной экспрессии белков, ответственных за репарацию ДНК и белков (преламин-A/C, белковая дисульфид-изомераза и 14-3-3 протеин тета), что согласуется с предыдущими исследованиями [20,29,30]. Белки, связанные со стрессовой реакцией аннексин-А1 и GSTP1, также были повышены. Аннексин-А1 считается предполагаемым медиатором глюкокортикоидной иммуносупрессивной активности [31] и ассоциируется с хроническим воспалением в пищеводе [32], в то время как фермент GSTP1 принадлежит к супергенному семейству ферментов, участвующих в защите клеток от окислительного стресса. Фермент GSTP1 является наиболее важной формой в пищеводе, с повышенной экспрессией во время кислотного рефлюкса [33]. Длительное воздействие желудочных ферментов и желчных кислот может усугубить повреждение слизистой оболочки пищевода, что приводит к метаплазии и неоплазии [34]. Желудочно-специфический фермент желудочная триацилглицероллипаза была повышена в РЭ и ПБ наряду с маркером желудочного эпителия гастрокином-1. Признаки неоплазии в ПБ и АП характеризовались снижением маркеров желудочно-кишечного эпителия кератина 13 и кератина 20 [35] по сравнению с РЭ, в то время как маркеры эпителиально-мезенхимного перехода виментин и десмин были повышены в ПБ и АП соответственно, по сравнению с контролем.

Ингибиторы протонной помпы (ИПП) являются основой лечения рефлюксной болезни. Изменения микробиома пищевода в результате снижения желудочной кислотности, вызванной ИПП, были изучены в нескольких исследованиях, и было показано, что они играют важную роль в формировании популяций микробов [36–39]. Наши результаты предполагают связь между лечением ИПП с небольшим снижением количества Bacteroidetes и Proteobacteria и повышенным содержанием Firmicutes (дополнительный рисунок S4), о чем ранее также сообщали Amir et al. [39]. Эффекты лечения ИПП на протеоме НЭРБ и РЭ показали снижение уровней белковой дисульфидизомеразы и сывороточного альбумина, связанных со стрессовой реакцией и детоксикацией, соответственно. Однако в ПБ лечение ИПП приводило к повышению уровня этих белков (дополнительная фигура S5). Связь между ИПП и неопластической прогрессией при ПБ противоречива. С одной стороны, снижение воздействия пищеводной кислоты на ИПП уменьшает воспаление и пролиферацию [40]. С другой стороны, терапия ИПП препятствует воздействию вторичных желчных кислот на пищевод, повышает уровень циркулирующего гастрина и вызывает активацию ЦОГ-2 [41,42]. Наши результаты показывают, что лечение ИПП может оказывать положительное влияние на НЭРБ и РЭ, но может отрицательно влиять на ПБ. Однако, учитывая, что основная цель нашего исследования не состояла в том, чтобы исследовать лечение ИПП, будущие исследования, включающие большие размеры выборки и лучший контроль переменных (например, время лечения ИПП, дозировка), необходимы для оценки влияния лечения ИПП на ПБ.

Микробиота АП менее четко определена, чем у РЭ и ПБ. Ранние культурные исследования образцов эзофагэктомии, выделенных из АП, не выявили каких-либо различий в организмах, изолированных в доброкачественной и злокачественной ткани [43,44]. Blackett et al. использовала современную технику секвенирования для выявления «U-образной» тенденции с сопоставимым грамположительным составом у здоровых контролей и АП, в отличие от микробиоты ГЭРБ [8]. Исследование с использованием Cytosponge-проб показало, что фирмикуты родов Lactobacillus и Streptococcus доминируют в АП [45]. Авторы предполагают, что виды Streptococcus способны выживать в микроокружении с низким содержанием питательных веществ благодаря ингибированию роста конкурентов, процессу, который может индуцировать toll-подобные рецепторы хозяина и повреждение тканей высвобождением токсина. Наши данные также показали сходную композицию микробиоты АП, состоящую из Staphylococcus aureus, Lactobacillus salivarius, Haemophilus influenzae, Sphaerochaeta sp. и Bifidobacterium sp., наряду с ростом Streptococcus infantis, вида, присутствующего в контроле и НЭРБ, но отсутствующего в РЭ и ПБ, Высокая распространенность молочнокислых бактерий (Lactobacillus, Bifidobacterium, Staphylococcus, Streptococcus) традиционно связана со здоровьем желудочно-кишечного тракта, учитывая их полезную роль в иммуномодуляции [46], выработке перекисей, кислот и бактериоцинов, а также белков, которые изменяют проницаемость эпителия и связывание с кишечными рецепторами патогенов [47]. Однако в контексте рака повышенные уровни молочной кислоты могут быть очень вредными. Нарушение метаболизма лактата является одним из признаков канцерогенеза [48]. Лактат может служить источником энергии в АП и других формах рака, вызывая гликолитические ферменты, что приводит к увеличению снабжения АТФ. Этот метаболит может также способствовать воспалению и стимулировать ангиогенез опухоли [49–51]. О последовательном увеличении количества молочнокислых бактерий (Streptococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium) сообщается на разных стадиях аденокарциномы желудка, и считается, что он напрямую способствует канцерогенезу [52]. In vivo доказательством роли бактерий, продуцирующих молочную кислоту, в канцерогенезе желудка является колонизация модели инсулин-гастрин-трансгенных мышей микробиотой, продуцирующей молочную кислоту, что приводит к интраэпителиальной неоплазии желудочно-кишечного тракта и повышенной регуляции генов, связанных с раком [53]. Другие факторы могут также способствовать развитию микробиоты АП. Дисфагия, распространенный симптом АП, часто уменьшает выбор питания пациента, который больше полагается на жидкие блюда, такие как молочные питательные смеси. Диетические изменения и последующая доступность макронутриентов могут оказать существенное влияние на состав микробиоты кишечника [54], при этом исследование показало увеличение состава лактобацилл в дистальном отделе пищевода мышей, получавших рацион с высоким содержанием жиров [55]. Аналогичным образом, возрастные изменения в выработке слюны, учитывая, что когорта АП имеет самый высокий средний возраст, может изменить здоровье полости рта и микробиоту [56]. Было показано, что снижение выработки слюны влияет на здоровье желудочно-кишечного тракта, например, замедленное заживление язв желудка и двенадцатиперстной кишки [57, 58]. Снижение микробного разнообразия и относительной численности также сообщалось в слюне пациентов с АП относительно контроля [59]. Предварительная связь между АП и здоровьем полости рта начинает появляться в литературе и может объяснить происхождение отдельной микробиоты АП.

Ограничением нашего исследования было то, что культивирование бактерий пищевода не проводилось наряду с секвенированием 16S рРНК. Экстрагированная ДНК в основном поступает из живых бактерий, но этот метод также выделяет ДНК из мертвых бактерий, а также бактериальных остатков. Следовательно, идентификация ДНК, специфичной для любых бактериальных штаммов, не обязательно указывает на присутствие живых бактерий в пищеводе. Еще одним ограничением было относительно небольшое количество белков, идентифицированных в наших биопсийных образцах тканей. Хотя наши результаты были сопоставимы с исследованиями с использованием эндоскопических биопсий аналогичного размера [60], они были значительно меньше по сравнению с протеомным анализом с использованием хирургических резекций АП (>300 белков) [30,61]. Небольшие диагностические биопсии слизистой оболочки в дозе 3-5 мг [62] могут не захватывать достаточное количество раковых клеток для всестороннего протеомного анализа по сравнению с гораздо более крупными хирургически резецированными тканями (30-60 мг) [61]. В результате классические маркеры рака, такие как молекула эпителиальной клеточной адгезии (EpCAM) и маркеры воспаления, не были идентифицированы в наших образцах АП. Наши результаты показывают, что сложность протеома пищевода превосходит аналитические возможности нашего подхода. Более комплексный протеомный подход может заключаться в использовании глубоких биопсий тканей и обогащении белков низкой плотности за счет использования библиотеки лигандов твердофазных гексапептидов.

В целом наши результаты подчеркивают важность микробного сообщества и его взаимодействия с хозяином при заболеваниях, связанных с кислотным рефлюксом. Мы предлагаем центральную роль для дисбиотической микробиоты в развитии НЭРБ и АП. Хотя трудно определить механизмы, лежащие в основе роли бактерий в патогенезе заболевания, роль микробиоты в стимуляции висцеральной гиперчувствительности и развития аденокарциномы была продемонстрирована в других органах желудочно-кишечного тракта. Таким образом, наши результаты также предполагают участие микробиоты слизистой пищевода в патогенезе НЭРБ и АП.

Дополнительные материалы: следующие материалы доступны в Интернете по адресу www.mdpi.com/2077-0383/9/7/2162/s1 или по этой ссылке (ниже даны комментарии к рисункам).

Рисунок S1: Альфа-анализ разнообразия контроля, неэрозивной рефлюксной болезни (NERD), рефлюкс-эзофагита (RE), пищевода Барретта (BE) и аденокарциномы пищевода (EAC) с использованием оценки богатства Chao1 и индекса разнообразия Шеннона.

Рисунок S2. Неметрический график многомерного масштабирования (nMDS) для анализа несходства Брэя-Кертиса (изобилия и состава) и анализа Джаккарда (наличия/отсутствия) контроля, неэрозивной рефлюксной болезни (NERD), рефлюкс-эзофагита (RE), пищевода Барретта (BE) и аденокарциномы пищевода (EAC).

Рисунок S3. Состав микробиоты внутри каждой группы: контроль, неэрозивная рефлюксная болезнь (NERD), рефлюкс-эзофагит (RE), пищевод Барретта (BE) и аденокарцинома пищевода (EAC).

Рисунок S4. Различия в составе бактериального типа между лечением ингибиторами протонной помпы при неэрозивной рефлюксной болезни (NERD), рефлюкс-эзофагите (RE) и фенотипах болезни пищевода Барретта (BE).

Рисунок S5: (А) белковая дисульфид-изомераза и (Б) сывороточный альбумин были обнаружены дифференцированно экспрессированными между обработанными ингибитором протонной помпы (ИПП) и необработанными протеомными образцами слизистой оболочки при неэрозивных рефлюксных заболеваниях (NERD), рефлюкс-эзофагите (RE) и пищеводе Барретта (BE).

К разделу: Роль микробиома в развитии и терапии рака

Литература

  1. El-Serag, H.B. Time trends of gastroesophageal reflux disease: A systematic review. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2007, 5, 17–26, doi:10.1016/j.cgh.2006.09.016.
  2. Tack, J.; Pandolfino, J.E. Pathophysiology of Gastroesophageal Reflux Disease. Gastroenterology 2018, 154, 277–288, doi:10.1053/j.gastro.2017.09.047.
  3. Fass, R. Non-erosive reflux disease (NERD) and erosive esophagitis—A spectrum of disease or special entities? Z Gastroenterol. 2007, 45, 1156–1163, doi:10.1055/s-2007-963628.
  4. Devesa, S.S.; Blot, W.J.; Fraumeni, J.F., Jr. Changing patterns in the incidence of esophageal and gastric carcinoma in the United States. Cancer 1998, 83, 2049–2053.
  5. Chang, J.T.; Katzka, D.A. Gastroesophageal reflux disease, Barrett esophagus, and esophageal adenocarcinoma. Arch. Intern. Med. 2004, 164, 1482–1488, doi:10.1001/archinte.164.14.1482.
  6. Ceranowicz, P.; Warzecha, Z.; Dembinski, A. Peptidyl hormones of endocrine cells origin in the gut—their discovery and physiological relevance. J. Physiol. Pharmacol. 2015, 66, 11–27.
  7. Yang, L.; Lu, X.; Nossa, C.W.; Francois, F.; Peek, R.M.; Pei, Z. Inflammation and intestinal metaplasia of the distal esophagus are associated with alterations in the microbiome. Gastroenterology 2009, 137, 588–597, doi:10.1053/j.gastro.2009.04.046.
  8. Blackett, K.L.; Siddhi, S.S.; Cleary, S.; Steed, H.; Miller, M.H.; Macfarlane, S.; Macfarlane, G.T.; Dillon, J.F. Oesophageal bacterial biofilm changes in gastro-oesophageal reflux disease, Barrett’s and oesophageal carcinoma: Association or causality? Aliment. Pharmacol. Ther. 2013, 37, 1084–1092, doi:10.1111/apt.12317.
  9. Liu, N.; Ando, T.; Ishiguro, K.; Maeda, O.; Watanabe, O.; Funasaka, K.; Nakamura, M.; Miyahara, R.; Ohmiya, N.; Goto, H. Characterization of bacterial biota in the distal esophagus of Japanese patients with reflux esophagitis and Barrett’s esophagus. BMC Infect. Dis. 2013, 13, 130, doi:10.1186/1471-2334-13-130.
  10. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. J. 2011, 17, 10–12.
  11. Caporaso, J.G.; Kuczynski, J.; Stombaugh, J.; Bittinger, K.; Bushman, F.D.; Costello, E.K.; Fierer, N.; Pena, A.G.; Goodrich, J.K.; Gordon, J.I.; et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat. Methods 2010, 7, 335–336, doi:10.1038/nmeth.f.303.
  12. DeSantis, T.Z.; Hugenholtz, P.; Larsen, N.; Rojas, M.; Brodie, E.L.; Keller, K.; Huber, T.; Dalevi, D.; Hu, P.; Andersen, G.L. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72, 5069–5072, doi:10.1128/AEM.03006-05.
  13. Anderson, M.J. A new method for non-parametric multivariate analysis of variance. Austral Ecol. 2001, 26, 32–46.
  14. Anderson, M.J. Distance-based tests for homogeneity of multivariate dispersions. Biometrics 2006, 62, 245–253.
  15. Wang, Y.; Naumann, U.; Wright, S.T.; Warton, D.I. Mvabund—An R package for model-based analysis of multivariate abundance data. Methods Ecol. Evol. 2012, 3, 471–474.
  16. Szklarczyk, D.; Gable, A.L.; Lyon, D.; Junge, A.; Wyder, S.; Huerta-Cepas, J.; Simonovic, M.; Doncheva, N.T.; Morris, J.H.; Bork, P.; et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Res. 2019, 47, D607–D613, doi:10.1093/nar/gky1131.
  17. Lind, T.; Havelund, T.; Carlsson, R.; Anker-Hansen, O.; Glise, H.; Hernqvist, H.; Junghard, O.; Lauritsen, K.; Lundell, L.; Pedersen, S.A.; et al. Heartburn without oesophagitis: Efficacy of omeprazole therapy and features determining therapeutic response. Scand. J. Gastroenterol. 1997, 32, 974–979, doi:10.3109/00365529709011212.
  18. Fass, R.; Fennerty, M.B.; Vakil, N. Nonerosive reflux disease—Current concepts and dilemmas. Am. J. Gastroenterol. 2001, 96, 303–314, doi:10.1111/j.1572-0241.2001.03511.x.
  19. Yamasaki, T.; Fass, R. Reflux Hypersensitivity: A New Functional Esophageal Disorder. J. Neurogastroenterol. Motil. 2017, 23, 495–503, doi:10.5056/jnm17097.
  20. Calabrese, C.; Marzano, V.; Urbani, A.; Lazzarini, G.; Valerii, M.C.; Liguori, G.; Di Molfetta, S.; Rizzello, F.; Gionchetti, P.; Campieri, M.; et al. Distinct proteomic profiles characterise non-erosive from erosive reflux disease. Aliment. Pharmacol. Ther. 2011, 34, 982–993, doi:10.1111/j.1365-2036.2011.04801.x.
  21. Distinct proteomic profiles characterise non-erosive from erosive Crouzet, L.; Gaultier, E.; Del’Homme, C.; Cartier, C.; Delmas, E.; Dapoigny, M.; Fioramonti, J.; Bernalier-Donadille, A. The hypersensitivity to colonic distension of IBS patients can be transferred to rats through their fecal microbiota. Neurogastroenterol. Motil. 2013, 25, e272–e282, doi:10.1111/nmo.12103.
  22. Blachier, F.; Davila, A.M.; Mimoun, S.; Benetti, P.H.; Atanasiu, C.; Andriamihaja, M.; Benamouzig, R.; Bouillaud, F.; Tome, D. Luminal sulfide and large intestine mucosa: Friend or foe? Amino Acids 2010, 39, 335–347, doi:10.1007/s00726-009-0445-2.
  23. Fillon, S.A.; Harris, J.K.; Wagner, B.D.; Kelly, C.J.; Stevens, M.J.; Moore, W.; Fang, R.; Schroeder, S.; Masterson, J.C.; Robertson, C.E.; et al. Novel device to sample the esophageal microbiome—The esophageal string test. PLoS ONE 2012, 7, e42938, doi:10.1371/journal.pone.0042938.
  24. Pei, Z.; Yang, L.; Peek, R.M.; Levine, S.M., Jr.; Pride, D.T.; Blaser, M.J. Bacterial biota in reflux esophagitis and Barrett’s esophagus. World J. Gastroenterol. 2005, 11, 7277–7283, doi:10.3748/wjg.v11.i46.7277.
  25. Snider, E.J.; Freedberg, D.E.; Abrams, J.A. Potential Role of the Microbiome in Barrett’s Esophagus and Esophageal Adenocarcinoma. Dig. Dis. Sci. 2016, 61,  2217–2225, doi:10.1007/s10620-016-4155-9.
  26. Eross, B.; Farkas, N.; Vincze, A.; Tinusz, B.; Szapary, L.; Garami, A.; Balasko, M.; Sarlos, P.; Czopf, L.; Alizadeh, H.; et al. Helicobacter pylori infection reduces the risk of Barrett’s esophagus: A meta-analysis and systematic review. Helicobacter 2018, 23, e12504, doi:10.1111/hel.12504.
  27. Blaser, M.J. Helicobacter pylori and esophageal disease: Wake-up call? Gastroenterology 2010, 139, 1819–1822, doi:10.1053/j.gastro.2010.10.037.
  28. Warzecha, Z.; Dembinski, A.; Ceranowicz, P.; Dembinski, M.; Sendur, R.; Pawlik, W.W.; Konturek, S.J. Deleterious effect of Helicobacter pylori infection on the course of acute pancreatitis in rats. Pancreatology 2002, 2, 386–395, doi:10.1159/000065086.
  29. Hsieh, L.Y. Understanding the Fibroblast-Extracellular Matrix Interaction Regarding Tissue Remodeling in EoE. UC San Diego, San Diego, CA, USA, 2019.
  30. Zhao, J.; Chang, A.C.; Li, C.; Shedden, K.A.; Thomas, D.G.; Misek, D.E.; Manoharan, A.P.; Giordano, T.J.; Beer, D.G.; Lubman, D.M. Comparative proteomics analysis of Barrett metaplasia and esophageal adenocarcinoma using two-dimensional liquid mass mapping. Mol. Cell. Proteom. 2007, 6, 987–999, doi:10.1074/mcp.M600175-MCP200.
  31. Hannon, R.; Croxtall, J.D.; Getting, S.J.; Roviezzo, F.; Yona, S.; Paul-Clark, M.J.; Gavins, F.N.; Perretti, M.; Morris, J.F.; Buckingham, J.C.; et al. Aberrant inflammation and resistance to glucocorticoids in annexin 1-/-mouse. FASEB J. 2003, 17, 253–255, doi:10.1096/fj.02-0239fje.
  32. Takaoka, R.T.C.; Sertorio, N.D.; Magalini, L.P.J.; Dos Santos, L.M.; Souza, H.R.; Iyomasa-Pilon, M.M.; Possebon, L.; Costa, S.S.; Girol, A.P. Expression profiles of Annexin A1, formylated peptide receptors and cyclooxigenase-2 in gastroesophageal inflammations and neoplasias. Pathol. Res. Pract. 2018, 214, 181–186, doi:10.1016/j.prp.2017.12.003.
  33. Brabender, J.; Lord, R.V.; Wickramasinghe, K.; Metzger, R.; Schneider, P.M.; Park, J.M.; Holscher, A.H.; DeMeester, T.R.; Danenberg, K.D.; Danenberg, P.V. Glutathione S-transferase-pi expression is downregulated in patients with Barrett′s esophagus and esophageal adenocarcinoma. J. Gastrointest. Surg. 2002, 6, 359–367, doi:10.1016/s1091-255x(02)00003-3.
  34. Jankowski, J.A.; Harrison, R.F.; Perry, I.; Balkwill, F.; Tselepis, C. Barrett’s metaplasia. Lancet 2000, 356, 2079–2085, doi:10.1016/S0140-6736(00)03411-5.
  35. Stairs, D.B.; Nakagawa, H.; Klein-Szanto, A.; Mitchell, S.D.; Silberg, D.G.; Tobias, J.W.; Lynch, J.P.; Rustgi, A.K. Cdx1 and c-Myc foster the initiation of transdifferentiation of the normal esophageal squamous epithelium toward Barrett’s esophagus. PLoS ONE 2008, 3, e3534, doi:10.1371/journal.pone.0003534.
  36. Jackson, M.A.; Goodrich, J.K.; Maxan, M.E.; Freedberg, D.E.; Abrams, J.A.; Poole, A.C.; Sutter, J.L.; Welter, D.; Ley, R.E.; Bell, J.T.; et al. Proton pump inhibitors alter the composition of the gut microbiota. Gut 2016, 65, 749–756, doi:10.1136/gutjnl-2015-310861.
  37. Freedberg, D.E.; Toussaint, N.C.; Chen, S.P.; Ratner, A.J.; Whittier, S.; Wang, T.C.; Wang, H.H.; Abrams, J.A. Proton Pump Inhibitors Alter Specific Taxa in the Human Gastrointestinal Microbiome: A Crossover Trial. Gastroenterology 2015, 149, 883–885, doi:10.1053/j.gastro.2015.06.043.
  38. Rosen, R.; Amirault, J.; Liu, H.; Mitchell, P.; Hu, L.; Khatwa, U.; Onderdonk, A. Changes in gastric and lung microflora with acid suppression: Acid suppression and bacterial growth. JAMA Pediatrics 2014, 168, 932– 937, doi:10.1001/jamapediatrics.2014.696.
  39. Amir, I.; Konikoff, F.M.; Oppenheim, M.; Gophna, U.; Half, E.E. Gastric microbiota is altered in oesophagitis and Barrett’s oesophagus and further modified by proton pump inhibitors. Environ. Microbiol. 2014, 16, 2905–2914, doi:10.1111/1462-2920.12285.
  40. Li, D.; Deconda, D.; Li, A.; Habr, F.; Cao, W. Effect of Proton Pump Inhibitor Therapy on NOX5, mPGES1 and iNOS expression in Barrett’s Esophagus. Sci. Rep. 2019, 9, 16242, doi:10.1038/s41598-019-52800-7.
  41. Dall’Olmo, L.; Fassan, M.; Dassie, E.; Scarpa, M.; Realdon, S.; Cavallin, F.; Cagol, M.; Battaglia, G.; Pizzi, M.; Guzzardo, V.; et al. Role of proton pump inhibitor on esophageal carcinogenesis and pancreatic acinar cell metaplasia development: An experimental in vivo study. PLoS ONE 2014, 9, e112862, doi:10.1371/journal.pone.0112862.
  42. Hu, Q.; Sun, T.T.; Hong, J.; Fang, J.Y.; Xiong, H.; Meltzer, S.J. Proton Pump Inhibitors Do Not Reduce the Risk of Esophageal Adenocarcinoma in Patients with Barrett’s Esophagus: A Systematic Review and Meta-Analysis. PLoS ONE 2017, 12, e0169691, doi:10.1371/journal.pone.0169691.
  43. Lau, W.F.; Wong, J.; Lam, K.H.; Ong, G.B. Oesophageal microbial flora in carcinoma of the oesophagus. ANZ J. Surg. 1981, 51, 52–55, doi:10.1111/j.1445-2197.1981.tb05905.x.
  44. Finlay, I.G.; Wright, P.A.; Menzies, T.; McArdle, C.S. Microbial flora in carcinoma of oesophagus. Thorax 1982, 37, 181–184, doi:10.1136/thx.37.3.181.
  45. Elliott, D.R.F.; Walker, A.W.; O’Donovan, M.; Parkhill, J.; Fitzgerald, R.C. A non-endoscopic device to sample the oesophageal microbiota: A case-control study. Lancet Gastroenterol. Hepatol. 2017, 2, 32–42, doi:10.1016/S2468-1253(16)30086-3.
  46. Dembinski, A.; Warzecha, Z.; Ceranowicz, P.; Dembinski, M.; Cieszkowski, J.; Gosiewski, T.; Bulanda, M.; Kusnierz-Cabala, B.; Galazka, K.; Konturek, P.C. Synergic Interaction of Rifaximin and Mutaflor (Escherichia coli Nissle 1917) in the Treatment of Acetic Acid-Induced Colitis in Rats. Gastroenterol. Res. Pract. 2016, 2016, 3126280, doi:10.1155/2016/3126280.
  47. Madsen, K.; Cornish, A.; Soper, P.; McKaigney, C.; Jijon, H.; Yachimec, C.; Doyle, J.; Jewell, L.; De Simone, C. Probiotic bacteria enhance murine and human intestinal epithelial barrier function. Gastroenterology 2001, 121, 580–591, doi:10.1053/gast.2001.27224.
  48. San-Millan, I.; Brooks, G.A. Reexamining cancer metabolism: Lactate production for carcinogenesis could be the purpose and explanation of the Warburg Effect. Carcinogenesis 2017, 38, 119–133, doi:10.1093/carcin/bgw127.
  49. Huhta, H.; Helminen, O.; Palomaki, S.; Kauppila, J.H.; Saarnio, J.; Lehenkari, P.P.; Karttunen, T.J. Intratumoral lactate metabolism in Barrett’s esophagus and adenocarcinoma. Oncotarget 2017, 8, 22894– 22902, doi:10.18632/oncotarget.15284.
  50. Doherty, J.R.; Cleveland, J.L. Targeting lactate metabolism for cancer therapeutics. J. Clin. Investig. 2013, 123, 3685–3692, doi:10.1172/JCI69741.
  51. Sonveaux, P.; Copetti, T.; De Saedeleer, C.J.; Vegran, F.; Verrax, J.; Kennedy, K.M.; Moon, E.J.; Dhup, S.; Danhier, P.; Frerart, F.; et al. Targeting the lactate transporter MCT1 in endothelial cells inhibits lactateinduced HIF-1 activation and tumor angiogenesis. PLoS ONE 2012, 7, e33418, doi:10.1371/journal.pone.0033418.
  52. Vinasco, K.; Mitchell, H.M.; Kaakoush, N.O.; Castano-Rodriguez, N. Microbial carcinogenesis: Lactic acid bacteria in gastric cancer. Biochim. Biophys. Acta Rev. Cancer 2019, 1872, 188309, doi:10.1016/j.bbcan.2019.07.004.
  53. Lertpiriyapong, K.; Whary, M.T.; Muthupalani, S.; Lofgren, J.L.; Gamazon, E.R.; Feng, Y.; Ge, Z.; Wang, T.C.; Fox, J.G. Gastric colonisation with a restricted commensal microbiota replicates the promotion of neoplastic lesions by diverse intestinal microbiota in the Helicobacter pylori INS-GAS mouse model of gastric carcinogenesis. Gut 2014, 63, 54–63, doi:10.1136/gutjnl-2013-305178.
  54. Wu, G.D.; Chen, J.; Hoffmann, C.; Bittinger, K.; Chen, Y.Y.; Keilbaugh, S.A.; Bewtra, M.; Knights, D.; Walters, W.A.; Knight, R.; et al. Linking long-term dietary patterns with gut microbial enterotypes. Science 2011, 334, 105–108, doi:10.1126/science.1208344.
  55. Zhao, X.; Liu, X.W.; Xie, N.; Wang, X.H.; Cui, Y.; Yang, J.W.; Chen, L.L.; Lu, F.G. Lactobacillus species shift in distal esophagus of high-fat-diet-fed rats. World J. Gastroenterol. 2011, 17, 3151–3157, doi:10.3748/wjg.v17.i26.3151.
  56. Xu, F.; Laguna, L.; Sarkar, A. Aging-related changes in quantity and quality of saliva: Where do we stand in our understanding? J. Texture Stud. 2019, 50, 27–35, doi:10.1111/jtxs.12356.
  57. Konturek, S.J.; Dembinski, A.; Warzecha, Z.; Brzozowski, T.; Gregory, H. Role of epidermal growth factor in healing of chronic gastroduodenal ulcers in rats. Gastroenterology 1988, 94, 1300–1307, doi:10.1016/0016-5085(88)90667-1.
  58. Warzecha, Z.; Kownacki, P.; Ceranowicz, P.; Dembinski, M.; Cieszkowski, J.; Dembinski, A. Ghrelin accelerates the healing of oral ulcers in non sialoadenectomized and sialoadenectomized rats. J. Physiol. Pharmacol. 2013, 64, 657–668.
  59. Chen, X.; Winckler, B.; Lu, M.; Cheng, H.; Yuan, Z.; Yang, Y.; Jin, L.; Ye, W. Oral Microbiota and Risk for Esophageal Squamous Cell Carcinoma in a High Risk Area of China. PLoS ONE 2015, 10, e0143603, doi:10.1371/journal.pone.0143603.
  60. Roesch-Ely, M.; Leipold, A.; Nees, M.; Holzinger, D.; Dietz, A.; Flechtenmacher, C.; Wolf, T.; Zapatka, M.; Bosch, F.X. Proteomic analysis of field cancerization in pharynx and oesophagus: A prospective pilot study. J. Pathol. 2010, 221, 462–470, doi:10.1002/path.2726.
  61. O’Neill, J.R.; Pak, H.S.; Pairo-Castineira, E.; Save, V.; Paterson-Brown, S.; Nenutil, R.; Vojtesek, B.; Overton, I.; Scherl, A.; Hupp, T.R. Quantitative Shotgun Proteomics Unveils Candidate Novel Esophageal Adenocarcinoma (EAC)-specific Proteins. Mol. Cell. Proteom. 2017, 16, 1138–1150, doi:10.1074/mcp.M116.065078.
  62. Danesh, B.J.; Burke, M.; Newman, J.; Aylott, A.; Whitfield, P.; Cotton, P.B. Comparison of weight, depth, and diagnostic adequacy of specimens obtained with 16 different biopsy

Будьте здоровы!

 

ССЫЛКИ К РАЗДЕЛУ О ПРЕПАРАТАХ ПРОБИОТИКАХ

  1. ПРОБИОТИКИ
  2. ДОМАШНИЕ ЗАКВАСКИ
  3. БИФИКАРДИО
  4. КОНЦЕНТРАТ БИФИДОБАКТЕРИЙ ЖИДКИЙ
  5. ПРОПИОНИКС
  6. ЙОДПРОПИОНИКС
  7. СЕЛЕНПРОПИОНИКС
  8. МИКРОЭЛЕМЕНТНЫЙ СОСТАВ
  9. ПРОБИОТИКИ С ПНЖК
  10. БИФИДОБАКТЕРИИ
  11. ПРОПИОНОВОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ
  12. ПРОБИОТИКИ И ПРЕБИОТИКИ
  13. СИНБИОТИКИ
  14. РОЛЬ МИКРОБИОМА В ТЕРАПИИ РАКА
  15. АНТИОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА
  16. АНТИОКСИДАНТНЫЕ ФЕРМЕНТЫ
  17. АНТИМУТАГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ
  18. МИКРОФЛОРА КИШЕЧНОГО ТРАКТА
  19. МИКРОБИОМ ЧЕЛОВЕКА
  20. МИКРОФЛОРА И ФУНКЦИИ МОЗГА
  21. ПРОБИОТИКИ И ХОЛЕСТЕРИН
  22. ПРОБИОТИКИ ПРОТИВ ОЖИРЕНИЯ
  23. МИКРОФЛОРА И САХАРНЫЙ ДИАБЕТ
  24. ПРОБИОТИКИ и ИММУНИТЕТ
  25. МИКРОБИОМ И АУТОИММУННЫЕ БОЛЕЗНИ
  26. ПРОБИОТИКИ и ГРУДНЫЕ ДЕТИ
  27. ПРОБИОТИКИ, БЕРЕМЕННОСТЬ, РОДЫ
  28. ДИСБАКТЕРИОЗ
  29. ВИТАМИННЫЙ СИНТЕЗ
  30. АМИНОКИСЛОТНЫЙ СИНТЕЗ
  31. АНТИМИКРОБНЫЕ СВОЙСТВА
  32. СИНТЕЗ ЛЕТУЧИХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
  33. СИНТЕЗ БАКТЕРИОЦИНОВ
  34. ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ПИТАНИЕ
  35. АЛИМЕНТАРНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ
  36. ПРОБИОТИКИ ДЛЯ СПОРТСМЕНОВ
  37. ПРОИЗВОДСТВО ПРОБИОТИКОВ
  38. ЗАКВАСКИ ДЛЯ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
  39. НОВОСТИ