Синтез бактериоцинов

БАКТЕРИОЦИНЫ ПРОБИОТИКОВ

Бактериоцины как альтернатива антибиотикам

БАКТЕРИОЦИНЫ - КАК АЛЬТЕРНАТИВА АНТИБИОТИКАМ

Пим. ред.: В разделе: Антимикробные свойства пробиотиков, уже давалась краткая информация о бактериоцинах, как о веществах, оказывающих бактерицидное и бактериостатическое действие на грамположительные и грамотрицательные патогенные бактерии, путем нарушения синтеза бактериальной мембраны и порообразующего действия. Также было отмечено, что антибиотической активностью выделяются и другие метаболиты пробиотических микроорганизмов, в частности, котороктоцепочечные жирные кислоты, перекись водорода (H2O2) и т.д. В этой связи, например, представляют большой интерес бактериоцины пропионовокислых бактерий, которые подавляют рост и выживаемость Listeria monocytogenes (возбудителя листериоза) и Yersinia enterocolitica (возбудителя иерсиниоза), а также подавляют рост грам-отрицательных (!) бактерий, дрожжей и плесневых грибов. Как видим, потенциал бактериоцинов огромен и требует дальнейшего изучения, особенно в свете проблемы антибиотиков.

О проблеме антибиотиков

Считается, что нерациональное использование антибиотиков в сочетании с самолечением привело к развитию бактерий, устойчивых к наиболее распространенным препаратам. В последние годы люди стали уделять большее внимание данной проблеме [1].

Ученые пытаются разрабатывать новые виды антибиотиков для борьбы с болезнями бактериального происхождения. Однако из всех синтезируемых молекул лишь 0,01% имеют антимикробную активность. И зачастую эти новые соединения имеют высокую себестоимость или оказывают высокотоксичное действие на человека [2].

Возможные пути решения

Одним из перспективных альтернативных методов борьбы с патогенными бактериями долгое время считали фаготерапию — лечение больных бактериальными инфекциями введением в организм бактериофагов. Бактериофаги — это вирусы, способные уничтожать бактерий. В поисках бактериофагов, которые будут бороться с патогенными бактериями, достигли определенных успехов, но при всех преимуществах данного способа нашли и ряд минусов. Самый главный — это то, что бактериофаги являются очень специфичными к определенному штамму бактерий. Получается, что даже если будет подобран бактериофаг для лечения какой-то болезни, не факт, что он сможет справиться со всем разнообразием бактерий, ее вызывающих [4]. Однако бактериофаги применяют уже несколько лет в стоматологии, причем довольно успешно, и это дает шанс фаготерапии найти более широкое применение [5].

Другим популярным способом в попытках заменить антибиотики является использование бактериоцинов:

БАКТЕРИОЦИНЫ

Краткое описание действия бактериоцинов:

Бактериоцины — большое семейство секретируемых бактериями пептидов, обладающих антимикробной активностью и действующих против других штаммов того же вида или близкородственных видов [6]. Бактериоцины синтезируют почти все известные бактерии.

Известно, что бактерии бывают грамположительные и грамотрицательные. И те, и другие подавляют близкородственные виды и тем самым прекращают их рост согласно механизмам, описанным на рисунке 1.

Механизм действия бактериоцинов грамположительных и грамотрицательных бактерий

Рисунок 1. Механизмы действия бактериоцинов. а — Механизм действия бактериоцинов грамположительных бактерий: низин и некоторые другие бактериоцины класса I ингибируют синтез пептидогликана, связываясь с липидом II, и образуют поры; бактериоцины класса II, такие как лактококцин А, связываются с порообразующей рецепторной маннозо-фосфотрансферазной системой (Man-PTS). б — Механизм действия бактериоцинов грамотрицательных бактерий: микроцин B17 (MccB17) ингибирует ДНК-гиразу, MccJ25 ингибирует РНК-полимеразу, а MccC7-C51 ингибирует аспартил-тРНК-синтетазу (*для увеличения рисунка нажмите на изображение)


Рисунок можно объяснить и более простым образом. В левой части изображено действие бактериоцинов грамположительных бактерий: по сути, они приводят к образованию дырок в мембране, и клетка просто погибает. В правой — показан механизм действия бактериоцинов, продуцируемых грамотрицательными бактериями: они блокируют синтез каких-либо важных ферментов, что также приводит к гибели клетки.

Альтернативное использование

Бактериоцины обладают рядом преимуществ, позволяющим заявить — они являются жизнеспособной альтернативой антибиотикам [7]:

  • антимикробная активность (как определено in vitro и in vivo);
  • низкая токсичность;
  • широкий и узкий спектр действия разных пептидов;
  • возможность производства in situ (с лат. — «на месте») пробиотиками;
  • возможность создания на их основе биоинженерных конструкций.

Можно сказать о том, что, вероятно, в скором будущем появятся новые способы борьбы с инфекционными бактериальными заболеваниями в случае успешного изучения особенностей функционирования бактериоцинов, что станет достойной альтернативой антибиотикам.

В последнее время также появляется много информации на тему возможности использования бактериоцинов в борьбе с раком. Что может сделать их почти панацеей нашего времени в случае успешного внедрения в медицинскую практику [11].

СИНТЕЗ БАКТЕРИОЦИНОВ

Подробнее о механизме действия бактериоцинов:

Бактериоцин субтилозин

Синтез бактериоцинов - наследственная особенность микроорганизмов, проявляющаяся в том, что каждый штамм способен образовывать один или несколько определенных, строго специфичных для него антибиотических веществ.

Антибиотические свойства полезных бактерий исследуется давно. Так, например, антимикробный эффект тех же молочнокислых бактерий издавна использовался для продления срока годности пищевых продуктов [12]. Классические работы Л. Пастера открыли первые страницы в изучении этой группы микроорганизмов [13]. По мнению ряда исследователей, образование органических кислот из углеводов приводит к снижению рН среды и предотвращает развитие других микроорганизмов [14]. Кроме того, бактерицидным действием на специфические группы микроорганизмов, включая патогенные формы, развивающиеся в продуктах питания в процессе хранения и выделяющие энтеротоксины, обладают белковые вещества, выделяемые некоторыми видами бактерий - бактериоцины [15].

Бактериоцины представляют собой комплекс пептидов с молекулярной массой от 2 до 35 кДа, существенно отличающихся друг от друга по физико-химическим характеристикам и биологическим эффектам [17, 18]. Выявлено, что на проявление антагонистической активности бактериоцинов, влияют температура, электрическое поле, рН, состав, консистенция среды, присутствие Ca2+ и Mg2+ и другие факторы [18, 19, 20].

К числу общих свойств бактериоцинов относится их чувствительность к температуре, хотя это свойство также может варьировать в широких пределах. Некоторые разрушаются при температуре 48-50°С, другие кратковременно выдерживают температуру 60-70°С, а отдельные сохраняют активность даже при 100°С.  Низин выдерживает кипячение до 120°С без потери активности.

Бактериоцины чувствительны к воздействию протеаз и имеют различный молекулярный вес (30000-100000 Да). Белок бактериоцина связан с липополисахаридом клеточной оболочки, но только белковая часть молекулы обладает антибактериальной активностью [22, 23].

На основании физико-химических свойств, аминокислотного состава, способов выведения, а также антимикробного спектра действия бактериоцины различные исследователи разделяют на три основных класса: I, II, III [19, 24, 25].

Бактериоцины I класса

К первому классу бактериоцинов относятся лантибиотики (небольшие пептиды <5 кДа), низкомолекулярные катионные, гидрофобные, устойчивые к нагреванию пептиды, в состав которых входят такие редкие тиоэфирные аминокислоты, как лантионин и β-метиллантионин, дегидроаланин, дегидро-бутирин, и несколько тиоэфирных мостиков, которые замещают дисульфидные связи и придают этим белковым соединениям некоторую полициклическую структуру [17]. К этой группе относятся низины, образуемые Lactococcus (Streptococcus) lactis, эпидермин, галлидермин, продуцентом которого является St. gallinarum, а также субтилин (B. subtilis).

Бактериоцины II класса

Большинство бактериоцинов относится ко II классу. Представляют собой низкомолеку-лярные катионные термостабильные пептиды (не содержащие лантионин), сохраняющие свою активность при широком диапазоне рН (3–9), слабо иммуногенные и нетоксичные для человека и животных [17, 31, 32]. Они вызывают повреждение цитоплазматической мембраны грамположительных бактерий, а по современным данным и грамотрицательных бактерий [21, 32, 33, 34]. Бактериоцины II класса чаще всего синтезируются как препептиды, а затем без модификации их аминокислотных остатков, в процессе секреции из клетки продуцентов утрачивают свои лидирующие компоненты. Гены, необходимые для продукции бактериоцинов II класса (регуляторные, гены, кодирующие препептид (или пептид), обеспечивающие транспорт через мембрану и устойчивость бактерий к собственному антимикробному пептиду), располагаются в плазмидах или в хромосоме.

Бактериоцины III класса

Бактериоцины этого класса представляют собой антимикробные термочувствительные белки с молекулярной массой более 30 кДа, способные расщеплять муреин клеточной стенки. К их числу относится энтеролизин А.

Механизм действия бактериоцинов

Учитывая большое разнообразие химического строения бактериоцинов, можно предположить, что они воздействуют на жизненно важные функции чувствительных клеток, но большинство действуют, образуя в мембране поры или каналы, способствующие нарушению мембранного потенциала чувствительных клеток [35, 36].

Анионные липиды цитоплазматической мембраны являются основными рецепторами бактериоцинов молочнокислых бактерий для стимуляции порообразования. Бактериоцины I класса могут вызывать формирование пор по типу клиноподобной модели, в то время как бактериоцины II класса способны функционировать, создавая поры, посредством которых пептиды располагаются параллельно мембранной поверхности и оказывают влияние на структуру мембран [37].

Наиболее хорошо изучен механизм действия бактериоцинов на примере низина (см. рис.2).

При изучении действия низина стало ясно, что часть C-конца молекулы деполяризует цитоплазматическую мембрану, что ведет к мгновенной остановке синтеза компонентов клеточной стенки и всех биосинтетических процессов в клетке. Основной характер действия низина - это взаимодействие с отрицательно заряженными мембранами (билипидный слой), предпочтительно с мембранами, содержащими анионные липиды. Грамположительные бактерии имеют более высокие концентрации анионного липида в их цитоплазматической мембране по сравнению с грамотрицательными. Бактериоцин сначала связывает его C-конец с анионными липидами, после чего N-конец опускается в липид мембраны и пептид принимает параллельное положение на мембранной поверхности. И, в конечном счете, целый пептид имеет возможность переместиться по всей длине поры [35].

Механизм действия бактериоцинов

Рисунок 2. Механизм действия бактериоцинов

Низин ингибирует синтез муреина клеточной стенки. В результате действия антибиотика происходит накопление промежуточного липида, с которым низин образует прочный комплекс, что и приводит к остановке дальнейшего синтеза пептидогликана бактериальной стенки. Низин может вызывать лизис клеток вследствие необратимой деструкции клеточной мембраны, которая регулирует осмотическое давление клетки. Он изменяет поверхностное натяжение цитоплазматической мембраны, что приводит к нарушению клеточной   проницаемости и, как следствие этого, к бактериальному лизису (от греч. lýsis - разложение, распад).


2. ПРОПИОНИЦИНЫ

Бактериоцины пропионовокислых бактерий

propionibacterium freudenreichiiНесмотря на то, что пропионовая кислота и пропионаты являются доминирующими антимикробными факторами ПКБ, у данных бактерий в 2004 г. были обнаружены и бактериоцины - экзогенные полипептиды (пропионицины), обладающие широким спектром действия: задерживали развитие многих грамотрицательных бактерий, а также грибов. Сегодня наиболее известны такие бактериоцины ПКБ, как пропионицин F, пропионицин T1, пропионицин SM1, пропионицин ПЛГ-1. Бактериоцины ПКБ характеризуются высокой стабильностью в широком диапазоне рН и температур. Они активны в кислотной, нейтральной и щелочной среде и термостабильны, оказывают антагонистическое действие в отношении грам-отрицательных бактерий, дрожжей и плесени.

Известны также и другие ингибирующие вещества-полипептиды ПКБ, такие, как PAMP и BLIS. Активация белка PAMP происходит только за пределами клетки, что довольно нетипично по отношению к другим бактериоцинам. PAMP, подвергшийся воздействию протеиназы К в концентрации 40 мкг / мл, приводит к образованию активного бактериоцина с молекулярной массой 6383 да. Другое ингибирующие вещество BLIS подавляет рост P. аспеѕ таким образом, данный белок может иметь потенциальное применение в фармацевтической промышленности для борьбы с акне.

1. Биосинтез и роль бактериоцинов, синтезируемых PAB (Propionic acid bacteria)

Бактериоцины представляют собой синтезированные в рибосомах пептидные или белковые молекулы с антимикробным действием, которые вырабатываются грамотрицательными и грамположительными бактериями. Согласно литературным данным, до 99% бактерий обладают способностью к биосинтезу по крайней мере одного бактериоцина (Klaenhammer, 1993). Первоначально считалось, что эти вещества проявляют активность исключительно в отношении микроорганизмов, связанных с продуцентом данного бактериоцина. Однако последующие исследования показали, что они оказывают влияние на микроорганизмы родов, отличных от продуцента, включая патогенные микроорганизмы, такие как Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus и Clostridium spp. Активность, стабильность и способ действия бактериоцинов определяются их аминокислотным составом и молекулярной структурой (Jack et al. 1995; Schillinger et al. 1996).

В последние годы потребители проявляют большой интерес к продуктам питания без химических консервантов; таким образом, был проведен ряд исследований по биологическим методам сохранения пищевых продуктов. Одним из решений могут быть бактериальные метаболиты, проявляющие антимикробный эффект, представляющие собой альтернативу химическим консервантам, например бактериоцинам или живым бактериоцингенным культурам. Эти соединения считаются нетоксичными для человека; они чувствительны к воздействию, в частности, пепсина и трипсина (они подвергаются деградации в пищеварительном тракте), и не было установлено отрицательного влияния бактериоцинов на органолептические и сенсорные свойства пищи (Cabo et al. 2001; Cleveland et al. 2001). Применение бактериоцинов в качестве биоконсерванта в пищевой и кормовой промышленности требует понимания характеристик этих соединений с особым акцентом на их структуру, механизм действия и стабильность. Кроме того, необходима легализация бактериоцинов в качестве пищевых добавок. Недаром стоит и экономическая проблема, связанная с оптимизацией условий их производства. PAB широко используются в производстве пищевых продуктов, что делает их интересными в качестве потенциального источника соединений с антимикробными свойствами (Faye et al. 2000; Miescher et al. 2000; Brede et al. 2004; Faye et al. 2004; van der Merwe et и др. 2004; Gwiazdowska и Trojanowska 2005; Gwiazdowska 2010).

Классические и дермальные бактерии рода Propionibacterium обладают способностью продуцировать бактериоцины. Большинство этих соединений продуцируются классическими видами, такими как P. thoenii, P. jensenii и P. freudenreichii (Al-Zoreky et al. 1991; Faye et al. 2000; Miescher et al. 2000; Ben-Shushan и др., 2003; Brede et al., 2004; van der Merwe et al., 2004; Gwiazdowska and Trojanowska, 2005).

Биосинтез бактериоцинов зависит от множества факторов: рН, температуры, состава и консистенции культуральной среды. Подходящий pH для производства бактериоцинов PAB зависит от используемого штамма. Производство наиболее интенсивного пропионицина PLG-1 происходит при pH 7, в то время как максимальное производство Jensenin G наблюдается при pH 6,4 (Lyon et al. 1993; Hsieh et al. 1996; Ekinci and Barefoot 1999; Brede et al. др. 2004). Faye et al. (2000) наблюдали различную оптимальную температуру во время биосинтеза пропионицина Т1 с использованием двух штаммов P. thoenii. Штамм LMG 2792 достиг наивысшей выработки пропионицина Т1 при температуре 22°С, тогда как штамм 419 достиг наивысшей выработки при температуре 30°С. Наилучшей средой для биосинтеза бактериоцинов с помощью PAB в лабораторных условиях являются бульон с лактатом натрия, MRS и среда, состоящая из свекловичной патоки и крутой кукурузы. Ben-Shushan et al. (2003) продемонстрировали, что продукция пропионицина PLG-1 в жидкой среде штаммом P. thoenii P127 была выше, чем у штамма GBZ-1, тогда как в полужидкой среде оба бактериоцина имели сравнимые уровни продукции. Бактериоцины из Propionibacterium характеризуются низкой антимикробной активностью в культуральной среде. Поэтому важно оптимизировать условия, связанные с биосинтезом бактериоцинов, и оптимизировать метод, подходящий для их разделения и эффективности. Из-за низкой концентрации бактериоцинов необходимо концентрировать жидкости после культивирования для определения его антимикробной активности (Lyon et al. , 1993; Ekinci и Barefoot, 1999; Morgan et al., 1999; Faye и др., 2000; Brede и др., 2004).

Механизм действия бактериоцинов может быть бактерицидным и/или бактериостатическим по природе. Большинство бактериоцинов, продуцируемых PAB, проявляют антагонистический эффект по отношению к видам Propionibacterium и Lactobacillus. Влияние бактериоцинов из PAB на близкородственные штаммы является переменным и зависит от степени родства штамма-продуцента и чувствительного штамма. На активность бактериоцинов дополнительно влияют доза, степень очистки, фаза роста чувствительных клеток, pH и температура окружающей среды (Cintas et al. 2001). Большинство бактериоцинов оказывают бактерицидное действие на чувствительные микроорганизмы через несколько минут после контакта. Некоторые бактериоцины (лактоцин, лейкоцин) (Upreti 1994) обладают бактериостатическим эффектом, таким образом подавляя размножение чувствительных микроорганизмов. Бактериоцины могут проявлять переменную активность в зависимости от чувствительного микроорганизма; Jensenina G оказывает бактерицидное действие против L. delbrüecki и бактериостатическое действие против P. acidipropionici (Grinstead and Barefoot 1992). Контакт бактериоцина с чувствительными клетками происходит посредством электростатических взаимодействий между положительно заряженной молекулой ингибитора и отрицательно заряженными фосфолипидами (тейхоевой кислотой и липотейхоевой кислотой), обнаруженными в клеточной мембране чувствительного микроорганизма. В результате этих взаимодействий в клеточной мембране образуются поры и ионные каналы (для некоторых бактериоцинов требуются специфические мембранные рецепторы). Образовавшиеся поры вызывают пассивный отток фосфата, ионов калия, аминокислот, АТФ и других соединений, что приводит к нарушению силы протонного двигателя, градиента рН или мембранного потенциала. Дефицит ионов, низкий уровень АТФ и уровень кофактора приводит к ингибированию синтеза белка и нуклеиновых кислот; для клеток также невозможно получать питательные вещества из окружающей среды, что приводит к их гибели (Bhunia et al., 1991; Jack et al., 1995; Chen et al., 1997; Marciset et al., 1997; Moll et al., 1999; Ryan et al. 1999). Некоторые бактериоцины нарушают синтез клеточной стенки посредством ингибирования биосинтеза петидогликанов на уровне трансгликозилирования или индуцируют лизис клеток чувствительных видов бактерий (deVuyst и Vandamme 1994; González et al. 1994).

Самый широкий диапазон активности был продемонстрирован для пропионицина PLG-1, синтезированного P. thoenii P127 (таблица 1), который обладает антимикробным действием в отношении PAB, молочнокислых бактерий, а также против грамотрицательных бактерий, дрожжей и плесени. Пропионицин GBZ-1 и тиеницин 447 обладают антибактериальным действием в отношении патогенного штамма P. acnes. Это предполагает возможность использования этого соединения в лечении угрей, вызванных P. acnes. Jensenin G ингибирует рост спор Clostridium botulinum типов A, B и E. Бактериоцины выбранного PAB, такие как пропионицин F, пропионицин T1 и пропионицин SM1, оказывают антагонистическое действие только для штаммов того же вида, что и продуцент. Неочищенные бактериоциновые препараты, содержащие пропионицин SM1, проявляют антимикробную активность против дрожжей, плесени, PAB и молочнокислых бактерий. После очистки пропионицин SM1 проявляет активность исключительно в отношении штамма P. jensenii DSM20274. Вероятно, это связано с тем фактом, что неочищенный препарат содержит соединения, поддерживающие активность бактериоцина, которые оказывают антибактериальное и фунгистатическое действие. Во многих случаях бактериоцины PAB оказывают более сильное влияние на молочнокислые бактерии, чем на другие PAB. Пропионицин GBZ-1 обладает наибольшей антагонистической активностью в отношении Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis ATCC 4797. Thoenicin 447 оказывает бактерицидное действие на Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus LMG 13551, тогда как он проявляет бактериостатический эффект в отношении P. acnes. Jensenin G характеризуется повышенной активностью по отношению к родам Lactobacillus и Lactococcus. Ферментативно активированные бактерии характеризуются антагонизмом в отношении штаммов P. acidipropionici, P. freudenreichii, P. jensenii, P. thoenii и шести штаммов рода Lactobacillus (Lyon и Glatz 1991; Ratnam et al. 1999; Faye et al. 2000 ; Miescher et al. 2000; Faye et al. 2002; Ben-Shushan et al. 2003; Brede et al. 2004; van der Merwe et al. 2004).

Таблица 1. Характеристика выбранных бактериоцинов пропионово-кислых бактерий

Бактерио-цины
Молекуляр-ный вес (Da)
стабильность
Инактиви-рующие ферменты
Диапазон
деятельности
ссылка
pH
Temp.
Propionicin PLG-1
9238
3–9
80°C below 15 min
Protease, pronase E, pepsin, trypsin, α-chymotrypsin
Bacteria G(+): Lactobacillus bulgaricusL. caseiPediococcus cervisiae i inne, bakterie G(-): Campylobacter jejuniEscherichia coliVibrio parahaemolyticus, and other, fungi: Aspergillus wentii (ATCC 1778), Apiotrichum curvatumCandida utilisC. lipolytica and other
Lyon and Glatz 1991; van der Merwe et al. 2004
Propionicin T1
7130.20
> 2.5
60–100°C below 15 min
Proteinase K
P. acidipropionici ATCC 4965, ATCC 4875, P. jensenii ATCC 4868, P17, P52, P. thoenii ATCC 4871, ATCC 4872 Lactobacillus sakei NCDO 2714 and other
Faye et al. 2000
Propionicin F
4397
No data
No data
Proteinase K
strains of the species Propionibacterium freudenreichii
Brede et al. 2004
Thoenicin 447
7130
1–10
100°C below 15 min
Proteinase K, pronase, pepsin, trypsin, α -chymotrypsin
Lactobacillus bulgaricus LMG 13551, Propionibacterium acnes ATCC 6919, ATCC 6922, ATCC 11827, ATCC 11828
van der Merwe et al. 2004
Propionicin SM1
19.942
No data
No data
No data
P. jensenii DSM 20274, DSM 20535
Miescher et al. 2000
Jensenin G
> 12.000
No data
100°C by 2 min
Proteinase K, pronase E, protease
P. acidipropionici P5, P. jensenii P54, Lactobacillus bulgaricus NCDO 1489, L. delbrueckii subsp. lactis ATCC 4797, Clostridium botulinum type A, B, E and other
Sip et al. 2009
Jensenin P
6000–9000
3–12
100 °C by 60 min
No data
P. jensenii B1264, P. thoenii P127 P. acidipropionici P5, P. thoenii P126, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, L. delbruecki subsp. delbruecki ATCC9649 and other
Ratnam et al. 1999
PAMP
6383
No data
No data
In concentration > 100 μg/ml: proteinase K, A, P, trypsin,
selected strains of species: P. acidipropionici, P. freudenreichiiP. jenseniiP. thoenii, bacteria of the genus Lactobacillus
Faye et al. 2000

2. Характеристика выбранных бактериоцинов

Наименьшим из известных в настоящее время бактериоцинов, синтезируемых Propionibacterium, является пропионицин F. Его молекулярная масса составляет 4397 Да, а его зрелая форма состоит из 47 аминокислот. Это первый бактериоцин, выделенный из культуры двух разных штаммов вида P. freudenreichii: LMGT 2956 и LMGT 2946 (Brede et al. 2004). Он кодируется геном pcfA, ниже которого находятся гены, котранскрибированные с помощью pcfA: pcfB, pcfC и pcfD. Предполагается, что пропионицин F активируется двумя процессами: первый процесс включает отсечение 101 аминокислоты из N-концевой части, а второй - удаление 111 аминокислот из C-концевой части пропептида. Пропропионицин F содержит цистеины, расположенные в месте обрезания аминоконца пробактериоцина; следовательно, согласно Brede et al. (2004), ген pcfB, кодирующий S-аденозилметионинтрансферазу, участвует в освобождении N-концевой части с сопутствующим образованием остатка цистеина. Отрезание С-концевой части объясняется геном pcfC, который кодирует пролин-аминопептидазу (Brede et al. 2005; Faye et al. 2011). Присутствие пролина в карбоксильной области пролинпептидазы может участвовать в посттрансляционном процессинге бактериоцина. Это слишком большой процесс, так как он состоит из обрезки фрагментов на обоих концах пробактериоцина, а в литературе приводятся случаи посттрансляционной обработки преимущественно одного конца. Гены pcfD (кодирующие ABC-транспортер) и pcfC отвечают за секреторную систему бактериоцина вне клетки. Мембранные белки, кодируемые pcfI, контролируют устойчивость клеток к пропионицину F (Brede et al. 2007).

Пропионицин SM1 является крупнейшим из известных в настоящее время бактериоцинов PAB, продуцируемых двумя различными штаммами P. jensenii. Он образован в виде 207-аминокислотного пропептида. Что касается большинства бактериоцинов, пропионицин SM1 секретируется вне клетки, когда отрезается сигнальный фрагмент из 27 аминокислот на N-конце. Сигнальный пептид имеет типичную структуру и обладает положительно заряженным амино-концом, центральной гидрофобной областью и полярным карбоновым концом (von Heijne 1988).

Пропионицин Т1 является положительно заряженным бактериоцином с молекулярной массой 7,1 кДа. Он демонстрирует активность против следующих бактерий: P. acidipropionici, P. jensenii, P. thoenii и P. acnes (патент США № 2003/0096365A1) и некоторых штаммов молочной кислоты. На основании идентификации гена, кодирующего пропионицин T1 (pctA), было установлено, что пропионицин T1 синтезируется в виде препептида из 96 аминокислот, содержащего лидерный пептид длиной 31 аминокислоту на его аминоконце, характеризующийся типичными признаками сигнального пептида, такими как положительно заряженный амино-конец, гидрофобность и специфическая область отсечки. В результате транслокации и процессинга второстепенной системой, препептид превращается в активный, 65-аминокислотный бактериоцин. Анализ ДНК выявил кодирующую белок область (orf2), расположенную на расстоянии 68 нуклеотидов ниже стоп-кодона структурного гена pctA; амино-конец этой области указывает на ее связь с ABC-транспортерами. Этот белок находится в плазматической мембране и обладает четырьмя АТФ-связывающими сайтами в цитоплазме. Поскольку пропионицин Т1 обладает характеристиками белков, секретируемых основным методом секреции (von Heijne, 1988), транспортер АТФ-связывающей кассеты (ABC), вероятно, не связан с его транспортом вне клетки. Расположение гена свидетельствует о том, что ABC-транспортер отвечает за устойчивость клетки к пропионицину Т1, то есть за удаление активного бактериоцина вне клетки или за его импорт и деградацию внутри клетки (Faye et al. 2000). ABC-транспортеры защищают продуцентов от низина, субтилизина и лактицина 481 (Klein and Entian, 1994; Siegers and Entian, 1995; Rince et al. 1997). Бактериоцин с полностью гомологичной последовательностью, аналогичной последовательности пропионицина Т1, представляет собой тиеницин 447, продуцируемый P. thoenii 447. Его зрелая форма состоит из 65 аминокислот. Аминокислотный состав тиеницина 447 содержит типичный паттерн сигнального пептида (Nielsen et al. 1997).

Особый тип белка, продуцируемый Propionibacterium, представляет собой так называемые патоген-ассоциированные молекулярные структуры (PAMP). Название относится к клеточным белкам, сходным с бактериоцинами, которые активируются только в результате активности протеазы. Они были впервые описаны Ratnam et al. (1999). Авторы представили нетипичный способ действия соединений, продуцируемых следующими штаммами: P. jensenii B1264, P. jensenii 4868 и P. freudenreichii 6207. P. jensenii B1264, при отсутствии протеолитических ферментов в культуральной среде, проявлял активность исключительно к пропионовым бактериям и Lactobacillus delbrueckii. Из-за активности протеазы область действия штамма PAMP была расширена до Lactococcus lactis subsp. lactis C2, Lactobacillus helveticus ATCC 15009 и Lb. plantarum PI 549. P. jensenii ATCC 4868 и P. freudenreichii 6207 с отсутствием протеолитических ферментов действовали только на PAB, тогда как в присутствии протеаз они ингибировали рост Lactobacillus. Faye et al. (2002) охарактеризованы PAMP, продуцируемые P. jensenii LMG 3032 и P. jensenii ATCC 4868.

PAMP производится в виде пропептида, состоящего из 198 аминокислот, с сигнальным пептидом длиной 27 аминокислот, расположенным на N-конце. Зрелая форма PAMP содержит фрагмент С-конца этого предшественника. Активация PAMP происходит только вне клетки, что довольно нетипично по отношению к другим бактериоцинам. Большинство бактериоцинов продуцируются в форме пептидных предшественников, а затем подвергаются внутриклеточным посттрансляционным модификациям или во время транслокации белка вне клетки, а затем они превращаются в биологически активные формы. Аминокислотная последовательность про-PAMP указывает на наличие сайтов обрезания, например, протеиназы К (специфическая область, расположенная между двумя аргининами). PAMP, подверженный действию протеиназы К в концентрации 40 мкг/мл, приводит к образованию активного бактериоцина с молекулярной массой 6383 Да (Neumann et al. 1993; Faye et al. 2002).

Было идентифицировано другое ингибирующее вещество (BLIS), продуцируемое PAB, именно штаммом P. jensenii B1264 (Wang et al. 2014). BLIS ингибирует рост P. acnes ATCC 6919; таким образом, белок может иметь новое потенциальное применение в фармацевтической промышленности для борьбы с прыщами.

3. Перспективы применения PAB-бактериоцинов

Большинство бактериоцинов, синтезированных классическим PAB, классифицируются как низкомолекулярные белки, молекулярная масса которых не превышает 10000 Да, за исключением пропионицина SM1, масса которого составляет 20 000 Да. Бактериоцины характеризуются высокой стабильностью в широком диапазоне рН и температур. Они активны в кислой, нейтральной и щелочной среде и являются термостабильными, не теряя активности после нескольких или 15-минутного нагревания при 100°C. В качестве примера, активность тиеницина 447 после 15-минутного нагревания при 100°C остается стабильной; активность падает (на 80%) только при 121°С. Jensenin G остается активным в течение до 2 минут нагревания при 100°C, но более длительное воздействие такой температуры (5, 10 и 15 минут) ограничивает его активность, но без ухудшения. Некоторые бактериоцины PAB, такие как йенсенин P, стабильны в среде, содержащей 0,1–1 моль / л NaCl, 0,1–2,0% SDS, 4 моль/л мочевины и в присутствии различных органических растворителей. Пропионицин PLG-1 и другие бактериоцины устойчивы к порче при длительном хранении, сохраняя активность до 25 недель (при температуре 4 и -25°C). Все эти характеристики доказывают полезность бактериоцинов PAB в производстве и сохранении пищевых продуктов (Hsieh et al. 1996; Ratnam et al. 1999; Ben-Shushan et al. 2003). Активность вышеупомянутых бактериоцинов, направленная на молочнокислые бактерии, может быть использована в производстве ферментированных молочных продуктов для предотвращения чрезмерного развития молочнокислых бактерий, что вызывает чрезмерное подкисление продукта. Подобные исследования были проведены, в частности, для jensenin G (Weinbrenner et al. 1997). Бактериоцины также были проверены на консервацию мяса. Ekİncİ и Candoğan (2014) оценивали влияние смеси йенсенина G и этилендиаминтрауксусной кислоты (EDTA) на Listeria monocytogenes и E. coli в кусочках свежего мяса. Комбинация jensenin G и EDTA привела к уменьшению числа Listeria bacilli, обнаруженных в говядине, с 4,78 до 3,49 log КОЕ / г, но это не оказало существенного влияния на снижение E. coli. Divek и Kollanoor-Johny. (2016) исследовали влияние двух подвидов P. freudenreichii (P. freudenreichii subsp. Freudenreichii и P. freudenreichii subsp. Shermanii) на три вида бактерий рода Salmonella (S. enteritidis, S. typhimurium и S. Heidelberg). Оба штамма P. freudenreichii оказались эффективными в подавлении размножения всех трех видов. Помимо этого, P. freudenreichiih оказал значительное влияние на снижение подвижности сальмонелл. Бактериоцины PBA также можно применять при производстве сыра, при ограничении образования красных пятен на сырах, вызванных пигментом, продуцируемым P. thoenii и P. jensenii, без какого-либо негативного влияния на заквасочные культуры P. freudenreichii (Sip et al. 2009). Антибактериальная активность некоторых бактериоцинов по отношению к P. acnes создает потенциал для применения таких белков в качестве добавок к препаратам против угрей (Wang et al. 2014). По-видимому, в будущем бактериоцины, продуцируемые Propionibacterium, могут широко использоваться в качестве ингибирующих агентов против развития нежелательных микроорганизмов в различных пищевых, косметических и фармацевтических продуктах.

Источник: Piwowarek K, Lipińska E, Hać-Szymańczuk E, Kieliszek M, Ścibisz I. Propionibacterium spp.-source of propionic acid, vitamin B12, and other metabolites important for the industry. Appl Microbiol Biotechnol. 2018 Jan;102(2):515-538.


Заключение

Перспективы использования бактериоцинов широки. Считается, что бактериоцины действительно можно использовать в качестве естественных консервантов продуктов питания. На практике, один из них, а именно низин, который выделяют из бактерии Streptococcus lactis [10], уже используется в коммерческих целях. Его можно встретить в составе на этикетках под именем E234.

Потребительский спрос на минимально обработанные пищевые продукты или «свежую еду» без химических консервантов стимулировал исследователей на поиск натуральных  антимикробных средств [37]. Кроме того, бактериоцины, в отличие от антибиотиков,  полностью расщепляются в организме, и вероятность возникновения осложнений от бактериоцинов минимальна, а применение антибиотиков имеет для человека отрицательные последствия. Однако сферы применения известных форм бактериоцинов, как уже отмечалось, ограничены из-за низкой активности при нейтральных или щелочных значениях pH. Поэтому поиск бактериоцинов с улучшенными физико-химическими свойствами и широким антимикробным спектром представляет большой интерес не только для пищевой промышленности, но и для фармацевтической - при создании альтернативных антибиотиков, что является одной из самых актуальных проблем в области микробиологии и биотехнологии.

К разделу:

АНТИМИКРОБНЫЕ СВОЙСТВА ПРОБИОТИКОВ

По теме см. также:

КОРОТКОЦЕПОЧЕЧНЫЕ ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ


Литература:

  1. Kai Li, Lici A. Schurig-Briccio, Xinxin Feng, Ashutosh Upadhyay, Venugopal Pujari, et. al.. (2014). Multitarget Drug Discovery for Tuberculosis and Other Infectious Diseases. J. Med. Chem.. 57, 3126-3139;
  2. Ville Ojala, Jarkko Laitalainen, Matti Jalasvuori. (2013). Fight evolution with evolution: plasmid-dependent phages with a wide host range prevent the spread of antibiotic resistance. Evol Appl. 6, 925-932;
  3. Cesar A. Arias, Barbara E. Murray. (2012). The rise of the Enterococcus: beyond vancomycin resistance. Nat Rev Micro. 10, 266-278;
  4. Alessandra C. Rios, Carla G. Moutinho, Flávio C. Pinto, Fernando S. Del Fiol, Angela Jozala, et. al.. (2016). Alternatives to overcoming bacterial resistances: State-of-the-art. Microbiological Research. 191, 51-80;
  5. Mor Shlezinger, Leron Khalifa, Yael Houri-Haddad, Shunit Coppenhagen-Glazer, Grégory Resch, et. al.. (2017). Phage Therapy: A New Horizon in the Antibacterial Treatment of Oral Pathogens. CTMC. 17, 1199-1211;
  6. Luc De Vuyst, Frédéric Leroy. (2007). Bacteriocins from Lactic Acid Bacteria: Production, Purification, and Food Applications. J Mol Microbiol Biotechnol. 13, 194-199;
  7. Paul D. Cotter, R. Paul Ross, Colin Hill. (2012). Bacteriocins — a viable alternative to antibiotics?. Nat Rev Micro. 11, 95-105;
  8. Sathiah Thennarasu, Dong-Kuk Lee, Alan Poon, Karen E. Kawulka, John C. Vederas, Ayyalusamy Ramamoorthy. (2005). Membrane permeabilization, orientation, and antimicrobial mechanism of subtilosin A. Chemistry and Physics of Lipids. 137, 38-51;
  9. Nalisa Khochamit, Surasak Siripornadulsil, Peerapol Sukon, Wilailak Siripornadulsil. (2015). Antibacterial activity and genotypic–phenotypic characteristics of bacteriocin-producing Bacillus subtilis KKU213: Potential as a probiotic strain. Microbiological Research. 170, 36-50;
  10. Ana Andréa Teixeira Barbosa, Hilário Cuquetto Mantovani, Sona Jain. (2017). Bacteriocins from lactic acid bacteria and their potential in the preservation of fruit products. Critical Reviews in Biotechnology. 37, 852-864;
  11. Sumanpreet Kaur, Sukhraj Kaur. (2015). Bacteriocins as Potential Anticancer Agents. Front. Pharmacol.. 6
  12. Нурушев М.Ж., Стоянова Л.Г., Бекеева С.А. и др. О проекте создания природного консерванта пищевых продуктов на основе бактериоцинов молочнокислых бактерий в Казахстане // Л.Н. Гумилев атындағы ЕҰУ Хабаршысы. - Вестник ЕНУ им. Л.Н. Гумилева. - 2011. - № 4.
  13. Тюрин М.В., Шендеров Б.А., Рахимова Н.Г. и др. К механизму антагонистической активности лактобацилл // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1989. - № 2. - С. 3–8.
  14. Шлегель Г. Общая микробиология. - М.: Мир, 1987. - 567 с.
  15. Блинкова Л.П., Альтшуллер М Л., Дорофеева Е С. и др. Молекулярные основы продукции и действия бактериоцинов // Журн. микробиол. - 2007. - № 2. - С. 97–104.
  16. Ускова М.А. Изучение свойств пробиотических молочнокислых бактерий как биологически активных компонентов пищи: автореф. ... канд. биол. наук. – М., 2010. - 28 с.
  17. Minah C.J., Morero R.D. Inhibition of enterocin CRL35 antibiotic activity by mono- and divalent ions // Lett. Appl. Microbiol. - 2003. - Vol. 37, N 5. - P. 374–379.
  18. Van den Berghe E., de Winter T., de Vuyst L. Enterocin A production by Enterococcus faecium FAIR-E 406 is characterised by a temperature and pH-dependent switch-off mechanism when growth is lim-ited due to nutrient depletion // Int. J. Food Microbiol. - 2006. - Vol. 107, Is. 2. - P. 159–165.
  19. Moreno M. R. F., Sarantinopoulos P., Tsakalidou, De Vuyst L. The role of appplication of enterococci in food and health // Int. J. Food Microbiol. - 2006. - Vol. 106. - P. 1–24.
  20. De Vuyst L., Leroy F. Bacteriocins from Lactic Acid Bacteria: Production, Purification, and Food Applications // Mol. Microbiol. Biotechnol. - 2007. -Vol. 13. - P. 194–199.
  21. Kraus A., Peschel D. Molecular Mechanisms of Bacterial Resistance to Antimicrobial Peptides. - Berlin; Heidelberg, 2006. - P. 231–250.
  22. Oscariz J.C., Pissabarro A.G. Classification and mode of action of membrane-active bacteriocins produced by gram-positive bacteria // Int. Microbiol. - 2011. - N 18. - P. 13–19.
  23. Segarra R.A., Gilmore M. S., Booth M C. Genetic structure of the Enterococcus faecalis plasmid pAD1-encoded cytolytic toxin system and its relationship to lantibiotic determinants // J. Bacteriol. - 2004. - Vol. 176. - P. 734–735.
  24. Bittencourt E., Suzart S. Occurrence of virulence-associated genes in clinical Enterococcus fae-calis strains isolated in Londrina, Brazil // J. Med. Microbiol. - 2004. - Vol. 53. - P. 1069–1073.
  25. Drider D., Fimland G., Héchard Y. The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 2006. - Vol. 70, N 2. - Р. 564–582.
  26. Klaenhammer T.R. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria // FEMS Microbiol. Rev. - 2008. - N 22. - P. 39–86.
  27. Diep D.B., Havarstein L.S., Nes I.F. A family of bacteriocin ABC transporters carry out proteolytic processing of their substrates concomitant with export // Mol. Microbiol. - 2008. - N 26. - P. 230–261.
  28. Ennahar S., Descamps N. Anti-Listerial effect of enterocin A, produced by cheese-isolated  Enterococcus faecium EFMO1, relative to other bacteriocins from lactic acid bacteria // J. Appl. Microbiol. - 2010. - Vol. 76, Is. 3. - P. 449–457.
  29. Brasseui R. Bennik M. H. J., Berlinda V. A novel bacteriocin from vegetable associated Enterococcus mundtii: full characterization and interaction with target organisms // Biochim. Biophys. Acta: Biomembr. - 2008. - Vol. 1679, Is. 1. - P. 47–58.
  30. Zendo T., Eungruttanagorn N., Fujoka S. Identification and production of a bacteriocin from En-terococcus mundtii QU2 isolated from soybean // J. Appl. Microbiol. - 2005. - Vol. 99, Is. 5. - P. 1181–1516.
  31. Farias R. N., Farias M. E., Holgado R. Letters in Purification and N-terminal acid sequence of enterocin CRL35, a pediocin-like bacteriocin produced by Enterococcus faecium CRL35 // Appl. Microbiol. - 2005. - Vol. 56. - P. 417–419.
  32. Dicks L. M. T., Balla E., Toit M. Characterization and Cloning of the Genes Encoding Enterocin 1071A and Enterocin 1071B, Two Antimicrobial Peptides Produced by Enterococcus faecalis BFE 1071 // Appl. Environ. Microbiol. - 2013. - Vol. 93, N 4. - P. 1298–1304.
  33. Criado R., Dzung B., Diep A. et al. Complete Sequence of the Enterocin Q-Encoding Plasmid pCIZ2 from the Multiple Bacteriocin Producer Enterococcus faecium L50 and Genetic Characterization of Enterocin Q Production and Immunity // Ibid. - 2006. - Vol. 72, N 10. - P. 6653–6666.
  34. Глушанова Н.А., Шендеров Б.А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro // Журнал микробиол. - 2005. - № 2. – С. 56-61.
  35. Surugau L.N. Peptide separation by capillary electrophoresis with ultraviolet detection: some simple approaches to enhance detection sensitivity and resolution // The Malaysian Journal of Analytical Sciences. - 2011. - Vol. 15 (2). - P. 273-287.
  36. Сультимова Т.Д. Выделение активных бактериоцинобразующих лактококков и их  практическое использование: автореф. … канд. биол. наук. – М., 2006. - 30 с.
  37. Ермоленко Е.И. Бактериоцины энтерококков: проблемы и перспективы использования // Вестник Санкт-Петербургского университета. Сер. 11. - 2009. - Вып. 3.

Будьте здоровы!

 

ССЫЛКИ К РАЗДЕЛУ О ПРЕПАРАТАХ ПРОБИОТИКАХ

  1. ПРОБИОТИКИ
  2. ДОМАШНИЕ ЗАКВАСКИ
  3. БИФИКАРДИО
  4. КОНЦЕНТРАТ БИФИДОБАКТЕРИЙ ЖИДКИЙ
  5. ПРОПИОНИКС
  6. ЙОДПРОПИОНИКС
  7. СЕЛЕНПРОПИОНИКС
  8. БИФИДОБАКТЕРИИ
  9. ПРОПИОНОВОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ
  10. ПРОБИОТИКИ И ПРЕБИОТИКИ
  11. СИНБИОТИКИ
  12. АНТИОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА
  13. АНТИОКСИДАНТНЫЕ ФЕРМЕНТЫ
  14. АНТИМУТАГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ
  15. МИКРОФЛОРА КИШЕЧНОГО ТРАКТА
  16. МИКРОФЛОРА И ФУНКЦИИ МОЗГА
  17. ПРОБИОТИКИ И ХОЛЕСТЕРИН
  18. ПРОБИОТИКИ ПРОТИВ ОЖИРЕНИЯ
  19. МИКРОФЛОРА И САХАРНЫЙ ДИАБЕТ
  20. ПРОБИОТИКИ и ИММУНИТЕТ
  21. ПРОБИОТИКИ и ГРУДНЫЕ ДЕТИ
  22. ДИСБАКТЕРИОЗ
  23. МИКРОЭЛЕМЕНТНЫЙ СОСТАВ
  24. ПРОБИОТИКИ С ПНЖК
  25. ВИТАМИННЫЙ СИНТЕЗ
  26. АМИНОКИСЛОТНЫЙ СИНТЕЗ
  27. АНТИМИКРОБНЫЕ СВОЙСТВА
  28. СИНТЕЗ ЛЕТУЧИХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
  29. СИНТЕЗ БАКТЕРИОЦИНОВ
  30. ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ПИТАНИЕ
  31. АЛИМЕНТАРНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ
  32. ПРОБИОТИКИ ДЛЯ СПОРТСМЕНОВ
  33. ПРОИЗВОДСТВО ПРОБИОТИКОВ
  34. ЗАКВАСКИ ДЛЯ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
  35. НОВОСТИ